水稻(Oryza sativa L.)作为三大重要粮食作物之一，在我国已有三千多年栽种历史^[1]。2015年中国水稻种植面积为3 021.6万hm²，总产量达20 822万t，占当年中国粮食总产量(62 143万t)的1/3以上^[2]。可见，确保水稻的高产稳产一直是我国粮食安全的重要目标。氮是植物体内许多化合物的重要成分，是水稻生长必不可少的大量营养元素。施用氮肥是保证水稻高产稳产的重要途径，但是大量施用氮肥也带来了一系列问题，作物贪青晚熟、倒伏，氨挥发、氧化亚氮排放造成全球气候变暖，氮的流失和淋失造成水体富营养化等其他生态环境问题^[3]。作物对氮肥的利用率低是造成这些生态环境问题的主要原因。近10年中国大陆主要粮食作物氮肥利用率分析结果表明，水稻氮肥表观利用率只有39%^[4]，即施氮肥量的50%以上残留在环境中。长期以来，如何提高水稻氮肥利用率一直是一个难题。

NH₄⁺和NO₃^-作为植物吸收和利用的主要无机氮源，对植物的生长发育和产量有着十分重要的影响。研究植物对NH₄⁺和NO₃^-的吸收、运输和利用机理，可以为提高植物氮肥利用率提供理论依据^[5]。稻田由于其特殊的淹水还原环境，土壤中硝化微生物活性较低，所以水稻土中无机氮源经常以NH₄⁺为主^[6]。水稻经常被认为是一种偏好NH₄⁺的植物种类，这暗示着供应NH₄⁺可能更有利于水稻生长和氮肥利用率的提高。然而，水稻在仅有NO₃^-供应的条件下也能良好生长，水稻对NH₄⁺和NO₃^-的偏好存在品种间差异^[7]。也有证据表明增加NO₃^-的供应能够促进水稻生长^[8]。由于水稻根系具有通气组织，其根系会释放氧气，所以在水稻根系周围也能发生硝化作用，产生NO₃^-。研究结果表明，根际硝化能力强的水稻品种对氮的吸收能力较强，根际硝化能力与水稻氮利用效率有关^[9]。最近的两篇报道表明硝酸盐转运体在提高水稻氮肥利用率方面具有重要作用^[10-11]。铵硝营养与水稻氮效率有着密切关系，但是具体如何调控铵硝营养来提高水稻氮效率，在理论上还存在不足，在操作上也有实际困难。

植物在吸收NH₄⁺和NO₃^-过程中，其根际pH会发生很大变化。吸收NH₄⁺导致根际pH降低，吸收NO₃^-导致根际pH升高。以前很多研究水稻铵硝营养的试验大多是水培试验，而且都没有采取适当措施来控制溶液pH的变化，但是实际田间条件下土壤本身具有pH缓冲的能力，NH₄⁺和NO₃^-的供应并不能大幅度改变根际土壤pH。水稻表观上的铵硝营养差异可能是由于溶液pH引起的。另外，水稻铵硝营养的相关研究主要集中在氮素营养本身，而对铵硝供应下水稻其他矿质营养元素的吸收特点关注较少。目前植物公认的必需营养元素有17种，水稻的正常生长发育不仅需要氮，同时也离不开其他各种必需营养元素的协同作用，任何一种必需营养元素的缺乏都会影响水稻生长和氮效率。因此，pH和其他矿质元素吸收是评价水稻铵硝营养时需要考虑的两个因子。

传统的稻田土壤pH一般在6.0以上，所以研究者开展水稻水培试验时，营养液pH一般控制在6.0左右。但是近些年来，由于氮肥的过量使用，稻田土壤pH也有下降的趋势，长三角地区约20%以上稻田土壤pH低于5.5^[12]。南方酸性红壤区也是水稻种植的主要区域，这一区域稻田土壤pH更低，特别是一些刚改为稻田的边际土地土壤更酸。一些酸性极强的酸性硫酸盐土壤也经常被用来种植水稻。因此，研究酸性条件下水稻氮效率提升机制也有很大意义。酸性土壤由于存在酸害、铝毒、锰毒等胁迫因子，作物氮素吸收和利用效率更低^[13]。同时，由于pH低，硝化微生物的活性更低，硝化作用更弱，无机氮源更加主要以NH₄⁺为主^[14-15]。水稻铵硝营养特点在酸性条件下可能有别于正常pH(如pH 6.0)，但是以往的研究很少关注酸性条件下水稻的铵硝营养。

基于以上这些因素考虑，本文在pH 5.0的水培条件下，通过设置添加和不添加pH缓冲剂MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)两个处理，研究了NH₄⁺和NO₃^-对水稻生长、氮效率和矿质养分含量的影响，以期为酸性条件下水稻的铵硝营养调控提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料及生长环境

选用粳稻(Oryza sativa L. ssp. japonica)品种‘一支腊选系’为试验材料。水稻水培试验在光照培养室中进行，白天温度为(30±2)℃，晚上温度为(25±2)℃，相对湿度为65% ± 5%，光照强度为50 klux，昼夜循环为光14 h/黑暗10 h。

1.2 试验处理

选择饱满一致的水稻种子，用10%双氧水表面消毒30 min，经蒸馏水清洗干净后，在25 ℃下蒸馏水浸泡24 h，避光催芽。然后将种子移于浮板上避光培养，培养溶液为0.5 mmol/LCaCl₂ (pH 5.0)。培养3 d后，转移到无氮营养液中见光培养。营养液配制参考木村大量元素和阿农微量元素的营养液配方，略作改变^[16]。该营养液含大量元素：MgSO₄·7H₂O (0.6 mmol/L)、KCl (0.55 mmol/L)、CaCl₂·2H₂O (0.36 mmol/L)和NaH₂PO₄ (0.18 mmol/L)；微量元素：Na₂EDTA-Fe(Ⅱ) (20 μmol/L)、H₃BO₃ (50 μmol/L)、MnCl₂·4H₂O (9 μmol/L)、ZnSO₄·7H₂O (0.7 μmol/L)和CuSO₄·5H₂O (0.3 μmol/L)、Na₂MoO₄·4H₂O (0.1 μmol/L)，pH 5.0。待水稻幼苗长至一心一叶时，选择生长一致的幼苗，移栽至不同氮处理的营养液中进行处理，两天更换一次营养液。

试验设计了2种供氮形态处理：NH₄⁺处理(NH₄Cl)、NO₃^-处理(NaNO₃)，同一氮源处理下再分为添加pH缓冲剂MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)和不添加MES。试验共4个处理：NH₄⁺、NO₃^-、NH₄⁺+MES、NO₃^-+MES。营养液中氮浓度为2 mmol/L，MES浓度为5 mmol/L。

1.3 水稻表型及干物质量的测定

在水稻生长至21 d时，分别量取水稻的株高及最长根长。叶片叶绿素利用SPAD叶绿素仪(SPAD- 502 PLUS，Konica Minolta)测定。表型测定后，分别采集地上部和根，用蒸馏水冲洗后于105 ℃烘箱中杀青1 h，随后70 ℃烘干至恒重，称重。

1.4 水稻矿质营养元素的测定

植株全氮含量的测定：H₂SO₄-H₂O₂消煮后，凯氏定氮仪(Hanon K9860)测定。

总吸氮量=地上部干物质量×地上部含氮量+地下部干物质量×地下部含氮量

氮吸收效率=总吸氮量/地下部干物质量

氮利用效率=总生物干物质量/总吸氮量

植株P、K、Ca、Mg、Zn、Fe、Mn、Cu矿质元素含量的测定：优级纯的HNO₃消煮后，采用ICP-AES (IRIS-Advantage，Thermo Elemental, MA, USA)检测。

1.5 数据处理和统计分析

数据处理采用Excel 2007，平均值的差异显著性检验使用统计软件SPSS 19，按照邓肯多重比较法检测。

2 结果与分析 2.1 NH₄⁺和NO₃^-对水稻生长的影响

不添加pH缓冲剂MES的条件下，水稻株高和叶绿素含量在NH₄⁺和NO₃^-处理之间没有显著差异；添加MES后，NH₄⁺处理的水稻株高显著高于NO₃^-处理，叶绿素含量也略高于NO₃^-处理(图 1A、B)。不管NH₄⁺还是NO₃^-处理，添加MES对水稻株高和叶绿素均有促进作用(图 1A、B)。对于水稻根长和根表面积，不论添加MES与否，NH₄⁺处理均显著低于NO₃^-处理(图 1C、D)。而且对NH₄⁺和NO₃^-处理，添加MES均显著增加了水稻根长，但是对根表面积没有显著影响(图 1C、D)。

水稻地上部干物质量在不同处理之间的变化规律(图 2A)与株高、叶绿素含量相似，地下部干物质量的变化规律(图 2B)类似于根长和根表面积。在不添加MES的条件下，水稻地上部干物质量在NH₄⁺和NO₃^-处理之间没有显著差异；添加MES后，NH₄⁺处理的水稻地上部干物质量显著高于NO₃^-处理。在不添加MES的条件下，NO₃^-处理的水稻地下部干物质量显著高于NH₄⁺处理；添加MES后，水稻地下部干物质量在NH₄⁺和NO₃^-处理间没有显著差异。MES显著提高了NH₄⁺和NO₃^-处理下的地上部干物质量以及NH₄⁺处理下的地下部干物质量，但是对NO₃^-处理下的地下部干物质量没有显著影响。

2.2 NH₄⁺和NO₃^-对水稻含氮量和氮效率的影响

不同处理之间地上部含氮量没有显著差异(图 3A)；NH₄⁺处理地下部含氮量显著高于NO₃^-处理，而添加MES后二者没有显著差异(图 3B)。

不管是否添加MES缓冲剂，水稻在NH₄⁺处理下的氮吸收效率均高于NO₃^-处理；MES降低了NH₄⁺处理的氮吸收效率，而对NO₃^-处理的氮吸收效率没有显著影响(图 4A)。不同处理之间的水稻氮利用效率差异不显著(图 4B)。

2.3 NH₄⁺和NO₃^-对水稻其他矿质元素吸收的影响

大中量元素的分析结果表明，不管是否添加MES，与NO₃^-处理相比，NH₄⁺处理提高了水稻地上部P含量，略降低了地下部P含量；水稻地下部和地上部NH₄⁺与NO₃^-处理间K含量差异不显著；NH₄⁺处理显著降低了水稻地下部和地上部Ca和Mg含量(表 1)。

对于微量元素而言，与Ca和Mg变化规律相似，NO₃^-处理的水稻地上部和地下部Zn、Cu和Mn含量显著高于NH₄⁺处理；而Fe的变化规律在地下部和地上部表现不一样，NH₄⁺处理的水稻地上部Fe含量显著高于NO₃^-处理，但是地下部规律正好相反(表 2)。

3 讨论 3.1 铵硝营养与水稻生长

根系是植物吸收养分的主要部位。前人研究表明，低浓度NO₃^-能作为一种信号诱导拟南芥侧根伸长，但是高浓度的NO₃^-抑制拟南芥侧根生长^[17]。在水稻上的研究结果表明，局部供应NO₃^-也能诱导侧根生长，但是整个根系供应NO₃^-却不能诱导侧根生长^[18]。NH₄⁺抑制水稻根系生长，但是NO₃^-对水稻根系生长的作用依赖于NO₃^-供应浓度，低浓度诱导，高浓度抑制^[19]。本文的结果也表明，水稻供应NO₃^-时, 不管是否添加pH缓冲剂，根长、根表面积、根物质量等指标均优于NH₄⁺营养，再次证明了NO₃^-比NH₄⁺更有利于水稻“发”根。

虽然水稻在NO₃^-下形成了较优的根系，但是从地上部表型(株高、叶绿素含量、地上部干物质量)看，NO₃^-并不比NH₄⁺营养具有优势。在不加pH缓冲剂的情况下，地上部各个生长表型在NH₄⁺和NO₃^-营养之间没有显著差异，由于介质pH本身(5.0)就较低，可能是NH₄⁺诱导的营养液酸化抑制了水稻生长。相反，在添加pH缓冲剂MES后，NH₄⁺营养的水稻株高、叶绿素含量和地上部干重高于NO₃^-，这与根系生长的结果正好相反。在目前试验条件下，NO₃^-可能并没有都作为营养元素被水稻所吸收，而在一定程度上作为信号诱导了水稻根系的生长，这必定会与地上部争夺氮和碳，从而导致NO₃^-处理地上部生长较差。

前人的研究结果表明，在缺氮的条件下，侧根长度与水稻根系氮素吸收具有相关性，但是在氮素供应充足的条件下，二者并没有相关性^[18]。本文采用2 mmol/L的供氮水平，属于氮充足供应，所以在本文试验条件下，根系大小并不是决定地上部生长的决定性因素。因此，在氮缺乏的土壤条件下，改良根构型可能是提高水稻养分吸收和改善水稻生长的主要策略，但是在氮供应充足的条件下，较大的根系可能不是提高地上部生长的必需条件。不同水稻品种根系生长对铵硝的响应存在差异^{[7, 18]}。鉴于目前对水稻铵硝营养的研究大都是在水培条件下开展的，将来需要进一步采用不同水稻品种，在水培和土培条件下联合研究水稻根和地上部生长对铵硝的响应差异。

3.2 铵硝营养与水稻氮效率

一般认为，由于稻田土壤处于淹水还原状态，施入的氮肥(大都为尿素)在脲酶作用下，水解为NH₄⁺后，很难进一步氧化为NO₃^-。虽然NH₄⁺是稻田土壤的主要无机氮源，但是由于水稻根际的特殊泌氧功能，这为NH₄⁺在水稻根际氧化为NO₃^-提供了可能性。研究结果表明，根际硝化作用对水稻氮素营养具有贡献，根际硝化能力强的水稻品种吸收氮的能力也强^{[9, 20]}。最近的两篇报道表明，两个NO₃^-转运体在提高水稻氮效率方面具有重要作用^[10-11]。然而，早在20世纪七八十年代，就有不少报道表明硝化抑制剂对水稻有增产作用，并能提高氮肥利用率^[21-23]。近些年来，也有研究发现硝化抑制剂能促进水稻增产，并提高氮肥利用率^[24-25]。这似乎又表明稻田保持较多的NH₄⁺能提高水稻产量和氮肥利用率。

本文试验结果表明，在pH 5.0的木村营养液并添加有pH缓冲剂的条件下，水稻在NH₄⁺条件下获得了较高的地上部干物质量和氮吸收效率，而在NO₃^-条件下获得了较好的根系构型包括根长、根表面积和根干物质量。水稻铵硝偏好和氮效率受到水稻品种、施肥方式、介质pH、氮肥水平、氧化还原电位、干湿交替状况等多个因素的影响。对于NH₄⁺，水稻可能更加容易吸收和同化这种无机氮源，并且消耗较少的能量，同时，较多的NH₄⁺会显著降低反硝化造成的氮损失。然而，稻田高浓度NH₄⁺的积累，会大幅度增加氨挥发造成的损失，特别是在pH较高的条件下^[26]。水稻吸收NO₃^-能够形成较为优良的根系，促进水稻对养分和水分的吸收，但是水稻吸收NO₃^-后仍需要将其同化为NH₄⁺，会消耗较多的能量，同时NO₃^-肥料价格昂贵，NO₃^-易于随水淋失和流失。因此，NH₄⁺和NO₃^-各有利弊，针对特定水稻品种和土壤条件，合理地调控稻田土壤无机氮的转化，保持适合的铵硝比例，是水稻高产高效的关键技术途径之一。

3.3 铵硝营养与水稻矿质元素吸收

前人对水稻和胡枝子的研究结果表明，在pH 4.5的条件下，NO₃^-处理的水稻根系Ca、Mg、Mn含量显著高于NH₄⁺处理^{[16, 27]}，但是水稻根和地上部氮含量在NH₄⁺和NO₃^-之间没有显著差异^[7]。与这些报道相类似，本文结果也表明水稻地上部N含量和K含量在NH₄⁺和NO₃^-之间差异较小，但是NH₄⁺提高了水稻地上部P含量，NO₃^-提高了水稻地上部和根的Ca、Mg、Zn、Cu、Mn含量，说明NH₄⁺能够促进水稻对P的吸收，而NO₃^-能促进水稻对Ca、Mg、Zn、Cu、Mn的吸收。

有意思的是，在NO₃^-处理下的水稻根Fe含量较NH₄⁺处理下的多，与此相反，水稻地上部Fe含量却是NH₄⁺处理下的要比NO₃^-处理下的多，这表明NH₄⁺能促进水稻将Fe从根向地上部转运，或者NO₃^-将Fe无效化在了根系。这与前人在玉米上的研究结果相一致^[28-29]。水培试验中我们利用的Fe为EDTA-Fe(Ⅱ)，二价Fe能被水稻根系所直接吸收，但是水稻具有通气组织，根系会释放氧气，溶液中的二价Fe遇到氧气容易被氧化成三价Fe，易在水稻根表面形成根表铁膜。NO₃^-供应下水稻根系Fe含量较多，有可能NO₃^-供应下根系泌氧较多，二价Fe被氧化成三价Fe，附着在根表面。另外一种原因可能是pH。当水稻吸收NH₄⁺时，根系释放H⁺，从而使根际pH下降；当吸收NO₃^-时，根系会释放HCO- 3或者OH^-，从而使根际pH升高。Fe的生物有效性受pH影响非常大，pH越高，Fe的有效性越低^[30]。前人的研究结果也表明质外体pH降低是NH₄⁺-N改善植物Fe营养的主要机制^[31-33]。

此次试验，虽然从SPAD值上看，铵硝处理间没有什么差异，但是肉眼观测到NO₃^-处理的叶片较为偏黄，而NH₄⁺处理的水稻叶片偏绿。植物叶片发黄的主要原因大多与缺N、缺Mg和缺Fe有关，而从地上部N和Mg的含量上看，NO₃^-处理的地上部Mg含量还比NH₄⁺处理的Mg含量高，同时，两个处理间地上部含氮量也没有显著性差异。因此，我们猜测缺Fe可能是导致此次试验中NO₃^-处理下叶片黄化的主要原因。Fe元素参与了植物细胞内多个代谢过程，其中也参与了叶绿素的合成，NO₃^-处理下大部分Fe元素被固定在了根系，传输到地上部的含量较少，这可能是导致NO₃^-处理下水稻叶片黄化的原因之一。我们也观察到NO₃^-处理的水稻根系往往会微微偏黄，可能是部分Fe被固定在了水稻根系，二价Fe氧化为三价Fe以后，导致NO₃^-处理根系颜色较深。前人对一种松科植物铵硝营养的研究结果表明，NO₃^--N处理的根Fe含量高于NH₄⁺-N处理，但是地上部Fe含量在铵硝之间没有显著差异^[34]。对灯心草属(Juncus acutiflorus)和鸭嘴豆(Cicer arietinum)的研究结果也表明，NO₃^--N更容易诱导植物缺Fe，而NH₄⁺-N却能缓解植物缺Fe ^[35-36]。将来有必要深入探究NH₄⁺和NO₃^-影响水稻吸收和转运Fe的分子机制。