2019, Vol. 51
全球变暖和土壤盐碱化是目前国际关注的重要环境问题。N2O作为一种重要的温室气体，具有辐射活性强、增温潜势(GWP)高、破坏臭氧层等特点[1-2]。盐碱土壤中高浓度的可溶性盐分由于渗透压和特异性离子对微生物细胞的毒性作用对土壤酶活性和微生物过程有重要影响[3]。农田土壤是大气中N2O的最重要排放源，而土壤中参与氮循环的微生物过程是N2O排放的主要驱动机制，其中起主导作用的过程为硝化作用和反硝化作用[4-5]。硝化作用包含两个过程：分别为氨氧化过程和亚硝酸盐氧化过程，而参与氨氧化过程的主要微生物为含有氨单加氧酶基因(amoA)的氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)或氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)，参与亚硝酸盐氧化过程的微生物则以硝酸细菌属(Nitrobacter)为主[6]，其中氨氧化过程作为整个硝化作用的限速步骤，该过程的中间产物(NO2–-N)部分会发生化学分解进而产生N2O[7-10]。2006年Costa等[11]根据新陈代谢途径的动力学理论推测，环境中应存在单步硝化作用和全程氨氧化微生物(complete ammonia oxidizer, Comammox)，即由一种微生物独立地完全氧化NH3为NO2–-N的过程。2015年Kessel等[12]和Daims等[13]分别研究发现3种经过纯培养的不同细菌(Candidatus Nitrospira nitrosa、Candidatus Nitrospira nitrificans和Candidatus Nitrospira inopinata)，Pinto等[14]团队发现一种未经过纯培养的细菌(类Nitrospira)，均具备独立将NH3氧化为NO2–-N的能力。赵伟烨等[15]在研究石灰性紫色土硝化作用及硝化微生物对不同氮源的响应时发现，亚硝酸盐氧化细菌占总微生物的比例高于氨氧化细菌和古菌，意味着石灰性紫色土中可能存在全程氨氧化微生物。因此，由全程氨氧化微生物驱动的单步硝化作用将成为微生物氮循环的重要组成部分，这对进一步了解环境中的硝化作用有重要意义。反硝化作用是在多种微生物的参与下，通过硝酸还原酶(nitrate reductase, Nar)、亚硝酸还原酶(nitrite reductase, Nir)、一氧化氮还原酶(nitric oxide reductase, Nor)和氧化亚氮还原酶(nitrous oxide reductase, Nos)的4步催化作用，最终将硝酸盐还原为N2，并在中间过程释放N2O[16]。
本研究分别选取AOB和含有Nar基因的硝酸盐还原菌作为硝化和反硝化过程中的研究对象，原因在于，在碱性土壤中，AOB比AOA活性更强，且AOB是土壤硝化作用的主要驱动者[17]。如Shen等[18]研究发现，在pH为8.3 ~ 8.7范围内的碱性砂质壤土中，AOB丰度与土壤pH和潜在硝化速率显著相关。而对于反硝化过程中功能基因微生物的选择则是考虑到目前国内外多选择含有亚硝酸盐还原酶基因(nirK/nirS)的亚硝酸盐还原菌为研究对象，而对于含有Nar基因的硝酸盐还原菌研究较少。
Zheng等[19]在河口沉积物中研究发现，β-AOB群落结构组成和沉积物中水溶性盐离子显著相关，而AOA群落结构组成与硝酸根浓度有关。Mosier和Santoro等[20-21]均研究发现，在河口沉积物中β-AOB中的amoA基因丰度超过AOA，且在0 ~ 33实用盐度单位(practical salinity unit, psu)范围内，随着盐度水平的增加而增加。含有Nar基因的硝酸还原菌是反硝化作用中NO3–-N向NO2–-N转化的主要驱动者，与N2O的排放有密切关系。而盐分含量作为土壤中重要的环境因子，对narG型反硝化细菌的丰度和多样性有重要影响。Yang等[22]研究发现，由盐水侵蚀导致的次生盐渍化显著改变了反硝化微生物的丰度和群落组成，其中narG型反硝化细菌的群落大小受到最大抑制。Wang等[23]在稻田土壤中通过室内培养试验并运用TRFLP和荧光定量PCR技术研究发现，外源高浓度硝酸盐的添加显著促进N2O排放速率，且该效应和narG型反硝化细菌丰度的增加密切相关。Yang等[24]在石灰性潮土中研究也发现N2O排放量和narG型反硝化细菌丰度显著相关。
内蒙古河套灌区位于我国西北黄河上中游地区的内蒙古段北岸的冲积平原，地势平坦，当地农业发展依赖引黄灌溉，其中引黄控制面积约116.2万hm2，有效灌溉面积57.4万hm2，面积居中国3个特大型灌区之首，长期过度灌溉导致灌区土壤次生盐渍化形势严峻[25-26]。内蒙古河套灌区地处半干旱地区，迄今该区仍有盐碱地34.53万hm2，盐荒地27.50万hm2，土壤盐碱化不仅制约着内蒙古河套灌区的农业发展，也对本地区的粮食安全构成了严重威胁[27-28]。
盐碱土壤较普通农田土壤中的环境条件更为复杂，其盐分含量和土壤pH对土壤中的微生物群落结构、丰度和多样性等有重要影响[29-31]。而盐碱土壤中N2O排放在硝化及反硝化微生物驱动下的响应规律研究较少。因此，本研究选取内蒙古河套灌区3种不同盐碱程度土壤通过室内培养试验并利用分子生物学技术探究硝化和反硝化微生物丰度与N2O排放之间的响应规律，以期为盐碱土壤中N2O排放的微生物学驱动机制的探究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 研究区概况土壤样品采集于内蒙古自治区巴彦淖尔市乌拉特前旗(40°28′ ~ 41°16′N，108°11′ ~ 109°54′E)，该地区属于典型的温带大陆性气候，该地处于我国西北黄河上中游地区，夏季高温干旱、冬季严寒少雪，年均气温7.7 ℃，年均降水量213.5 mm，降水量最大值集中在8月，年均日照3 212.5 h，无霜期167 d，对于内蒙古河套灌区的生态环境、气候特征具有广泛的代表性。该地区主要种植作物为小麦、玉米和向日葵。
1.2 样品采集土壤样品采集时间为2015年6月中旬，选取该地区3种典型不同盐碱程度农田土壤，并测定其盐分含量(表 1)，测定方法参考《土壤农业化学分析》[32]中的质量法。按照土壤盐化分级标准(表 2)，将样地(10 m×10 m)分别命名为轻度盐土(SA)、强度盐土(SB)、盐土(SC)，按照邻近原则采用“S”型布点法布置样点，每块样地布设3个样点，每个样点用土钻采集作物根区0 ~ 20 cm表层土壤，重复取样3次。混合新鲜土样去除碎石、秸秆及动植物残体无菌聚乙烯自封袋带回实验室，将土样分为两份，其中一份风干土样磨碎过2 mm筛用于土壤理化性质的测定及室内培养试验，另一份土样放入4 ℃冰盒内保存，于实验室内装于若干无菌离心管中–20 ℃保存用于土壤总DNA的提取。
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表 1 采样点信息 Table 1 Information of sample plots |
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表 2 土壤盐化分级标准[33] Table 2 Soil salinization classification |
土壤pH和EC值分别以1︰2.5和1︰1土水比，用土壤pH计和土壤便携式电导仪测定；紫外分光光度计法测定土壤NO3–-N含量；凯氏定氮法测定土壤总氮(TN)含量；重铬酸钾容量法-外加热法测定土壤有机碳(SOC)含量；流动分析仪测定土壤有效磷(AP)和速效钾(AK)含量。
1.3.2 土壤总DNA的提取及PCR的扩增称取0.5 g土壤样品，采用CTAB/SDS方法提取土壤总DNA，DNA样品于–20 ℃冰箱保存待用。功能基因的定量分析采用SYBR-GREEN法，反硝化细菌的特有功能基因narG的定量分析引物为narG-F(TCGC CSATYCCGGCSATGTC)和narG-R(GAGTTGTACC AGTCRGCSGAYTCSG)[34]，氨氧化细菌的特有功能基因amoA的定量分析引物为amoA-1F(GGGGTTTC TACTGGTGGT)和amoA-2R(CCCCTCKGSAAAGCC TTCTTC)[35]。
PCR扩增体系(25 µl)：10×PCR buffer 2.5 µl，dNTP(2.5 mmol/L) 3.2 µl，Primer F/R(5 µmol/L) 1 µl，Taq(5 U/μl) 0.125 μl，补ddH2O至25 µl；模板DNA：2 µl。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸20 s，40个循环；最终72 ℃延伸10 min。PCR产物采用AXYGEN公司DNA Gel Extraction Kit进行纯化。纯化连接到pEASY-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，对插入的细菌DNA片段进行序列测定。采用M13F测序引物对阳性克隆进行测序验证，依据测序结果验证标准品是否构建合格。PCR仪为美国AB公司7 500 fast，凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统。
1.3.3 标准曲线的建立利用核算定量仪测定质粒质量浓度得到氨氧化细菌amoA基因片段质量浓度为356 ng/μl，反硝化细菌narG基因片段质量浓度为110 ng/μl。将制备好的质粒标准品按照104 ~ 1010进行10倍系列稀释得到4个浓度梯度的标准模板，各取2 µl稀释标准品，每个稀释模板质量浓度取3个平行样，记录结果并取平均值，绘制熔点曲线，以不同模板拷贝数的对数值为纵坐标，以qPCR反应的循环数(Ct)为横坐标，绘制标准曲线。其中氨氧化细菌标准曲线为：y(lg浓度值)=-0.425 7 Ct + 5.280 2，相关系数R2=0.983 7；反硝化细菌标准曲线为：y(lg浓度值)=-0.365 6 Ct + 4.510 4，相关系数R2=0.997 8。同时将各样本基因组10倍稀释后取2 µl作模板，均用目的基因引物进行扩增，同时在60 ~ 95 ℃进行熔点曲线分析。
1.3.4 土壤N2O排放速率的测定称取SA-1 ~ SC-3共9份土壤样品100 g于310 ml培养瓶中，预培养实验：将5 ml灭菌去离子水分别加入9个培养瓶中，于(25±1)℃下培养7 d以激活土壤微生物。培养实验：用去离子水调节土壤质量含水量为25%，并用T型硅胶塞封口，于(25±1) ℃下恒温培养箱避光培养21d，取样时间分别为第1、2、3、4、7、10、13、16、21天，用连接三通阀的注射器抽取气体样品，并用Agilent6820型气相色谱仪测定气体样品的N2O质量浓度，取样结束后敞口通气2 h，重新加盖培养，同时利用称重法每隔2 ~ 3 d补充土壤水分以保证土壤含水量一致。
1.4 数据分析方法| $ {\rm{{N_2}O}} 排放速率：F = \frac{{\Delta C \times V \times {\rm M} \times \frac{{273}}{{273 + T}}}}{{d \times m \times 22.4 \times 1000}} $ | (1) |
式中：F代表N2O排放速率(µg/(kg·d))；V为培养瓶中气体有效体积(ml)；ΔC单位时间内气体浓度变化值(nl/(L·d))；M为N2O的摩尔质量(44)；T为培养箱的温度(K)；d为培养的天数(d)；m为培养瓶内的干土重(100 g)；22.4为273 K(绝对零度)时N2O的摩尔体积(L/mol)。
| $ 微生物丰度：{\rm{MA}} = \frac{{V \times n \times c}}{{N \times M}} $ | (2) |
式中：MA为微生物丰度(copies)；V为DNA总体积(µl)；n为DNA的物质的量(个/mol)；c为样品中检测目标的质量浓度：依据标准曲线，PCR反应的Ct值可通过换算得到样品片段的质量浓度(ng/µl)；N为pEASY-T碱基数为载体构建的标准品碱基对的数量(个)；M为脱氧核糖核苷酸平均分子量(607.4 g/mol)。
本研究采用Microsoft Excel 2010处理试验数据。采用SPSS 22.0软件对各数据组间的显著差异进行单因素方差分析(AVNOA)。采用Microsoft Excel 2010以及Orign pro 9.0软件作图，利用CANOCO 4.5 for windows软件进行除趋势对应分析(detrended correspondence，DCA)，采用线性拟合模型对N2O排放速率、amoA及narG功能基因丰度和环境因子进行冗余分析(RDA)。
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质的多重比较对3种不同盐碱程度土壤pH、EC、铵态氮、硝态氮、总氮、有机碳、有效磷和速效钾进行多重比较，结果如表 3所示。土壤铵态氮和有效磷含量无显著性差异(P > 0.05)；土壤pH、硝态氮、总氮和有机质呈显著性差异(P < 0.05)；土壤EC和速效钾呈极显著差异(P < 0.01)，二者均表现为轻度盐土 < 强度盐土 < 盐土。
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表 3 供试土壤理化性质 Table 3 Physical and chemical properties of soil samples |
由单因素ANVOA方差分析可知，不同盐碱程度土壤之间N2O平均排放速率具有明显差异性(F=107, P < 0.01，图 1)，3种不同盐碱土壤(SA、SB、SC)N2O平均排放速率分别为：16.9、30.8、69.6 µg/(kg·d)，即SA < SB < SC，结果表明，随着土壤盐碱程度的增加，N2O平均排放速率呈增加趋势。
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(图中小写字母不同表示不同盐碱土壤间差异显著(P < 0.01)，下图同) 图 1 不同盐碱程度土壤中N2O排放速率 Fig. 1 N2O emission rates from different salinization soils |
由单因素ANVOA方差分析可知，3种不同盐碱程度土壤之间AOB和narG型反硝化细菌丰度具有明显差异性(F=158，P < 0.01；F =352，P < 0.01，图 2)。不同盐碱程度土壤之间(SA、SB、SC)AOB丰度分别为：0.415×104、6.91×104、9.44×104 copies，表现为：SA < SB < SC；narG型反硝化细菌丰度表现为：SA < SB < SC，值分别为：2.61×104、5.36×104、13.4×104 copies。
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图 2 不同盐碱程度土壤amoA和narG基因丰度 Fig. 2 The abundance of amoA and narG genes from different salinization soils |
利用CANOCO软件RDA分析方法分析土壤理化性质对微生物基因丰度及N2O排放速率的影响，结果如图 3所示，其中第一主成分轴(94.5%)和第二主成分轴(5.2%)共解释环境变量的99.7%。由Monte Carlo法检验可知，土壤N2O平均排放速率与AOB和narG型反硝化细菌丰度具有显著的相关性(r = 0.863，P < 0.01；r = 0.975，P < 0.01)。土壤N2O平均排放速率分别与pH、EC、速效钾呈显著正相关(r = 0.968、0.983、0.987，P < 0.01)，土壤N2O排放速率与土壤有机碳(SOC)呈负相关(r = –0.800, P < 0.05)，土壤N2O平均排放速率与总氮和有效磷无明显相关性(P > 0.05)。
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(SOC：土壤有机碳，TN：总氮，AK：速效钾，AP：有效磷) 图 3 N2O排放速率与硝化及反硝化微生物丰度以及环境因子的冗余分析图 Fig. 3 Redundancy analysis of the correlation among N2O emission rates, the abundance of microorganisms and the soil properties |
本研究通过控制培养试验的室内温度和土壤质量含水量探究不同盐碱程度土壤N2O排放特征，研究发现，N2O排放速率随土壤盐碱程度升高而升高，即SA < SB < SC。该研究结果与Ruiz-Romero等[36]研究发现一致，N2O排放量随着电导率的升高而升高；而且，土壤电导率(EC)为56 mS/cm时，N2O累积排放量显著高于电导率为12 mS/cm的土壤。Marton等人[37]研究发现高的盐分含量抑制反硝化过程中的N2O还原酶活性，导致在厌氧条件下N2O累积排放量升高。
N2O是在微生物驱动下硝化过程和反硝化过程的中间产物，其中硝化过程中的氨氧化过程作为硝化作用中重要的限速步骤，其所涉及的主要微生物AOB在土壤氮素生物地球化学循环中具有重要作用，而反硝化过程中的NO3–-N还原为NO2–-N的过程是区分硝酸盐的异化作用和呼吸作用的关键步骤。因此，氨氧化过程对应的主要微生物AOB和反硝化过程中硝酸还原菌丰度对盐分的响应规律具有重要的研究意义。
本研究发现，3种不同盐碱土壤中，盐土中amoA和narG基因丰度最高。表明，在一定的盐分条件下，土壤中的盐分对硝化作用和驱动该过程的AOB丰度有促进作用。这一变化关系与Mosier和Francis[20]以及Santoro等[21]的研究结果相同。WANG等[38]利用膜生物反应器处理高盐高铵废水中研究发现，1% ~ 4%的盐度(NaCl)范围对硝化过程中NH4+-N向NO2–-N转化几乎没有影响，高通量测序显示，高的含盐量对AOB群落结构有选择效应，耐盐氨氧化微生物的生存导致微生物丰富度和多样性升高。Cortés-Lorenzo等[39]在水下固定床生物反应器中研究也发现，废水中的NaCl质量浓度低于3.7 g/L(EC = 12 mS/cm)时硝化过程不会被抑制。Sorokin等[40]在蒙古苏打盐湖中研究发现，AOB在0.1 ~ 1.0 mol/L总Na+盐度范围内能够生存，且最适宜盐度为0.3 mol/L。本研究所选3种不同盐碱程度土壤盐分分别为1.2、8.3和16.9 g/kg，其对应电导率分别为0.45、0.90和2.92 mS/cm，盐度范围均低于以上研究结果。因此，在适度盐度范围内，盐分的增加对AOB会产生选择效应进而导致该微生物丰度发生变化。盐分对narG型反硝化细菌丰度的影响主要是通过对硝酸盐还原过程对应酶活性的影响发挥作用。李小平等[41]通过对东湖沉积物中异化硝酸还原酶活性(dNaR)与硝酸还原菌数量关系发现，硝酸还原菌数量与dNaR活性呈显著正相关(P < 0.01)。刘浩荣等[42]利用土壤培养试验研究发现，喷施KCl可以增强小白菜叶片内硝酸还原酶活性。程玉静等[43]采用营养液栽培试验研究发现，外源Ca(NO3)2通过提高黄瓜幼苗体内NO3–-N含量，进而诱导硝酸还原酶(NR)活性升高。因此，在一定盐分条件下，土壤中的盐分通过增强硝酸还原酶活性进而增加硝酸还原菌的丰度。
RDA分析结果显示，N2O排放速率分别与AOB的amoA基因拷贝数及反硝化细菌的narG基因拷贝数呈显著正相关(r = 0.863，P < 0.01；r = 0.975，P < 0.01)，即在盐碱土壤中，N2O排放速率随amoA和narG基因丰度的升高而升高。陈晨等[44]研究发现，菜地土壤通过施加生物炭增加amoA基因丰度进而间接促进N2O排放。本研究发现硝酸还原菌中的narG基因丰度与N2O排放存在显著正相关，该研究结果与郑燕等[45]研究结果相似。卢静等[46]在研究水稻土短期落干过程对N2O排放通量和反硝化微生物丰度的影响时也发现，N2O排放通量与narG基因丰度呈极显著相关(P＜0.01)。虽然本研究结果有据可循，但是从DNA水平出发，研究amoA基因和narG基因丰度与N2O排放之间的关系有一定局限性。原因在于微生物功能基因丰度仅能反映该类微生物的多寡，另外，靶标基因可能并不全部参与表达，微生物功能基因丰度仅仅代表其潜在生理功能，并不能代表该类微生物活性[45]。而信使RNA(mRNA)作为生命活动重要承担者，在微生物活性的研究中常用于表征某一特定代谢过程的活跃程度[47]，因此需进一步从mRNA水平系统研究amoA基因和narG基因丰度与N2O排放之间的关系。土壤有机碳(SOC)对土壤的氮循环过程有重要影响进而间接影响N2O的排放。杨艳菊等[48]通过室内模拟试验，在25 ℃和60%田间持水量条件下研究SOC含量对水稻土N2O排放的影响发现，土壤N2O累积排放量与SOC含量呈正相关。兰宇等[49]通过田间试验，利用静态箱-气相色谱法研究秸秆还田方式对N2O排放和土壤理化性质的影响时发现，SOC促进土壤中的反硝化作用。SOC间接增加nosZ基因丰度进而促进N2O还原为N2释放到大气中，减少土壤N2O排放[50]。本课题组前期研究发现[51]，反硝化过程是盐碱土壤中N2O排放的主要途径，该过程N2O排放贡献率为60.35% ~ 72.46%。而pH对土壤的反硝化过程有重要影响，Feng等[52]在酸性矿质土壤中研究发现，反硝化过程中N2O排放量随土壤pH的增加而显著增加。目前，关于土壤速效钾含量对N2O排放的影响还未见直接报道，但速效钾作为土壤中重要的环境因子，其对SOC含量有重要影响。王霖娇等[53]研究发现，喀斯特石漠化生态系统土壤中SOC与速效钾存在极显著正相关(P < 0.001)。贡璐等[54]在研究塔里木盆地南缘典型绿洲土壤有机碳与环境因子的相关性时也发现，速效钾对SOC含量有显著影响(P < 0.05)。因此，土壤速效钾可以通过影响土壤SOC的含量间接影响N2O排放。
本研究运用荧光定量PCR技术定量不同盐碱程度土壤中参与氨氧化过程和硝酸盐的还原过程的AOB的amoA基因丰度和反硝化细菌的narG基因丰度，进而探究AOB和narG型反硝化细菌丰度与土壤中N2O排放之间的关系。该研究结果对从DNA水平揭示盐碱土壤N2O排放的微生物学机理具有一定意义，还需进一步通过与N2O排放实时相关的能反映氨氧化过程和硝酸盐的还原过程微生物活性的mRNA水平进行深入研究。
4 结论1) 不同盐碱程度土壤N2O平均排放速率表现为：轻度盐化土壤 < 强度盐化土壤 < 盐化土壤，随着盐碱程度的增加，N2O平均排放速率呈增加趋势。
2) 不同盐碱程度土壤中氨氧化细菌和narG型反硝化细菌丰度与N2O平均排放速率呈显著正相关(P < 0.01)，且随着盐碱程度(EC)的增加而增加。
3) 盐碱土壤N2O排放速率与土壤环境因子的冗余分析结果显示，土壤pH、EC、速效钾和N2O排放速率存在显著正相关关系(P < 0.01)，土壤有机碳和N2O排放速率存在负相关关系(P < 0.05)，土壤有效磷和总氮对N2O排放速率影响较小，未达到显著水平(P > 0.05)。
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