花生是我国重要的经济作物，我国的花生种植面积近年来一直维持在460万hm²以上，年均花生产量超过1 600万t^[1]。在其他主要农作物的单产基本都逐年增高的背景下，近年来，花生单产却逐年下降，2013—2015年全国平均单产分别为3 663.33、3 579.98、3 561.68 kg/hm^2[2]。科学施肥是保障作物产量的基础^[3]，因此，探索一种更加科学的肥料施用方式或是提升花生产量的重要手段。农作物秸秆中含有丰富的营养元素，是重要的肥料资源^[4]，腐殖酸则因其良好的生物化学活性而成为了近年来较为热门的新型肥料品种^[5-6]。秸秆还田和腐殖酸处理对花生产量的影响研究较多，且大部分研究结果都表明这两种施肥方式可显著提升花生产量^[7-8]。

光合作用是作物产量形成的根本途径^[9-10]，研究光合碳的分配对了解作物产量形成具有重要意义，而厘清不同施肥下花生光合碳的固定及转运过程是判断施肥是否科学、合理的前提。近年来，稳定性同位素标记技术的发展为研究光合碳在植物体内的转运提供了有力的技术支撑，水稻^[11]、玉米^[12]、小麦^[13]光合碳的转运和分配被先后揭示，为这些作物的科学栽培提供了科学支撑。例如，刘萍等^[11]人的研究发现在水稻栽培中适量增施氮肥能提升水稻向土壤中有机碳的输入；安婷婷等^[12]人的研究证明了覆膜栽培可显著促进玉米光合碳的固定。但是，花生光合碳在花生-土壤系统中的分配情况以及不同施肥处理尤其是农作物秸秆和腐殖酸这两种较为新型肥料的施用对光合碳分配的影响尚未见文献报道。因此，本研究通过¹³C脉冲标记技术，对不同施肥处理对光合碳在花生-土壤系统中的分配展开定量研究，这对认识花生光合碳的固定、运转以及确定花生的科学施肥方式具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试土壤样品采自中国科学院鹰潭农业生态试验站附近大田0 ~ 20 cm表层土，土壤为发育自第四纪红黏土。该区年平均降水量1 789 mm，年蒸发量1 318 mm，年平均气温为17.6 ℃，无霜期在258 d左右，属亚热带湿润季风气候区。2017年8月选择代表性田块，通过多点采样形成混合样品。样品经风干，挑去细根和石块等，磨细过5 mm筛备用。供试土壤基本理化性质为：pH 5.32，有机碳10.06 g/kg，全氮1.24 g/kg，全磷0.62 g/kg，全钾12.60 g/kg，碱解氮158.03 mg/kg，有效磷21.92 mg/kg，速效钾400.00 mg/kg。供试花生品种为赣花五号。试验中所用氮肥为尿素、磷肥为钙镁磷肥、钾肥为氯化钾、秸秆为粉碎后过40目筛的玉米秸秆、腐殖酸提取自风化褐煤。腐殖酸提取方法采用国际腐殖酸协会(IHSS)推荐的方法。

1.2 试验设计

盆栽试验采用内径25 cm、高30 cm的塑料盆，每盆装过5 mm筛的风干土5 kg。试验共设4个不同的施肥处理，分别为NPK、NPKS、NPKA和对照CK，每个处理6盆，3盆连续脉冲标记处理，3盆作为不标记对照。各处理施肥方式如表 1所示。尿素、钙镁磷肥、氯化钾和玉米秸秆都以基肥的方式拌入土壤中并充分混匀。向花盆中充分浇水，各花盆浇水量一致。2 d后，将用过氧化氢表面消毒30 min并催芽2 d后的花生种子播在花盆中，所选取的花生种子大小较为一致，催芽2 d后出芽大小也较为一致。每个花盆播种3颗花生种子。出苗后15 d和30 d，向NPKA处理的6个花盆添加腐殖酸，腐殖酸浓度为C 100 mg/L，每盆添加100 ml。其他处理添加等量自来水。直至试验结束，不再向各处理追加肥料，农艺管理措施相同。

1.3 脉冲标记

出苗后的第40、60、80天，从各处理固定选择3盆花生进行脉冲标记。标记箱体为定制的有机玻璃箱，规格为长×宽×高=105 cm×70 cm×100 cm，玻璃箱顶部装有2个小型风扇，并留有温度计和4个滴定管插孔。标记大体过程如下：①将盆栽花生放入标记箱底座，将4个500 ml的烧杯放置在底座上，其中2个烧杯加入Ba¹³CO₃(¹³C丰度为99%)5.3 g，另2个烧杯加入等量BaCO₃；②在箱体内壁均匀、少量地涂抹一层肥皂水(箱体内壁水蒸气的凝结会大幅降低光照强度，影响标记效率，涂抹肥皂水可有效防止水蒸气在内壁的凝结)，将有机玻璃箱放在底座槽内，向底座槽内注冷水密封，启动风扇。先使花生光合15 min以消耗标记箱中原有的CO₂；③标记时先用黑布遮住整个有机玻璃箱，通过特制的滴定管向装有Ba¹³CO₃的一个烧杯中注入2 mol/L HCl溶液200 ml，产生800 μl/L的¹³CO₂，反应5 min后，将黑布打开，让花生在有机玻璃箱内进行光合作用；④光合50 min后重复步骤③；⑤步骤④完成以后分别向另外2个装有BaCO₃的烧杯中加入等量的HCl溶液，两次加入时间同样间隔50 min。⑥标记结束后，取下有机玻璃箱，通风一段时间后将花生放回原位。标记过程中用冰块降温，温度控制在35 ℃内。

1.4 样品采集与处理

出苗后第90 d，也就是第3次标记结束后第10 d，对花生进行破坏性采样。从花盆中轻轻拔出花生以后，将花生根系立即剪下，地上部和根系用去离子水洗净以后放入烘箱中，先调至110 ℃杀青30 min，再调至70 ℃恒温烘干。样品烘干以后，称干物质量；用研钵完全磨碎，过100目筛。花盆中的土壤充分混匀，称总湿重，每个花盆准确称取10 g后放入70 ℃烘箱，烘干后计算含水量；烘干的土样磨碎后过80目筛。样品全碳采用重铬酸钾容量法测定，δ¹³C值用同位素质谱仪(FlashEA-Delta Advantage)测定。

1.5 数据分析

一般情况下，自然土壤或植物的自然丰度用δ¹³C值来表示，其计算公式如下：

$ \delta {}^{13}C\left( ‰ \right){\rm{ = }}\left( {\frac{{{R_{样品}}}}{{{R_{{\rm{PDB}}}} - 1}}} \right) \times 1000 $

(1)

式中：R_样品=¹³C/¹²C_样品，R_PDB=¹³C/¹²C_PDB，取值为0.011 237 2。通过R_样品值和样品的全碳含量，可以通过以下公式计算得到样品中的¹³C含量。

$ {}^{13}{{\rm{C}}_{样品}}{\rm{ = }}样品全碳 \times \left( {\frac{{{R_{样品}}}}{{1 + R样品}}} \right) $

(2)

$ ^{13}{\rm{C}}净输入量{ = ^{13}}{{\rm{C}}_{未标记样品}}{ - ^{13}}{{\rm{C}}_{标记样品}} $

(3)

数据由Microsoft Excel 2013进行整理，分析均通过SPSS 19.0完成。

2 结果 2.1 不同施肥处理下花生生物量的差异

不同施肥处理下，花生的总生物量和地上部生物量均无显著差异，但在根系生物量上差异显著(表 2，P < 0.05)。NPKA处理的根系生物量显著高于其他3组处理，较CK、NPK和NPKS分别高22.04%、19.47%和53.38%。NPKS处理的根系生物量则显著低于其他3组处理，常规NPK处理的根系生物量与CK相比无显著差异。

2.2 不同施肥处理下¹³C丰度的差异

NPKS处理地上部δ¹³C达2 242.43‰，显著高于其他处理(P < 0.05)，NPK处理地上部δ¹³C显著低于其他处理，NPKA和CK处理地上部δ¹³C居NPKS和NPK之间且无显著差异(表 3)。NPK处理根系δ¹³C同样显著低于其他处理，NPKS、NPKA和CK的δ¹³C差异不显著。NPKA处理的土壤δ¹³C显著高于其他处理，NPKS最低，NPK和CK的δ¹³C差异不显著。

2.3 不同施肥处理下光合碳(¹³C)含量的差异

不同施肥处理下，地上部分同化的光合碳(¹³C)均无显著差异(表 4)。NPKA处理的根系同化的光合碳(¹³C)显著高于NPK，但是NPKA、NPKS和CK之间，以及NPKS、NPK和CK之间则差异不显著。进入土壤的光合碳(¹³C)在NPKA处理下最高，达127.03 mg，其他处理之间无显著性差异。NPKA同化光合碳(¹³C)的总量显著高于NPK处理(P < 0.05)，NPKA、NPKS和CK之间，以及NPKS、NPK和CK之间差异不显著。全部处理同化的光合碳(¹³C)总量为3 185.32 mg，3次标记试验添加的¹³C总量为4.19 g，计算得到本试验中¹³C的总回收率为76.02%。

2.4 不同施肥处理下光合碳(¹³C)分配比例的差异

NPKS、NPK和CK地上部分光合碳(¹³C)分配比例比较接近，在53.41% ~ 57.62%之间，差异不显著(表 5)；NPKA处理地上部分光合碳(¹³C)比例则显著低于其他处理，不足50%。NPKS处理的根系光合碳(¹³C)比例显著低于CK，而NPKA、NPK和CK之间，以及NPK、NPKS和NPKA之间均无显著差异。NPKA处理的土壤光合碳(¹³C)分配比例超过40%，显著高于其他处理，NPKS、NPK和CK之间差异不显著。

3 讨论

不同施肥处理对花生生物量的影响已多有报道^[14-15]，本研究中，不同施肥处理对花生总生物量和地上部生物量并无显著影响，可能有以下两方面的原因：①研究中采用的土壤肥力本身较高，即使不施肥，其本身的营养物质也满足花生在栽培期间正常生长发育的需求。②花生的栽培时间为90 d，试验结束时，花生刚开始结荚。而在结荚之前，花生对N、P、K的需求均不足全生育期的30%，结荚期和饱果期对3种养分的需求则超过70%^[16]，也即在栽培期内，花生对营养物质的需求较低。因此，在本研究中，不同施肥处理对花生总生物量无显著影响。

研究发现，不同施肥处理下花生根系生物量具有显著性差异，NPKA的根系生物量较CK、NPK和NPKS分别高22.04%、19.47%和53.38%。这说明，在本研究中，腐殖酸的添加显著地促进了花生根系的生长发育，这与前人的研究一致^[17]。在其他作物上，也有类似的结论报道。例如，经过腐殖酸处理后的玉米在移栽2个月后其根系长度较对照增加23%^[18]。Canellas等^[19]人也发现腐殖酸的施用能显著增加玉米根系的长度和侧生根的增殖位点。Adani等^[20]人则发现施用腐殖酸能促进番茄根系干重增加18%。关于腐殖酸促进植物根系生长的原理，目前主要认为是腐殖酸诱导了植物质膜H⁺-ATPase的含量，含植物质膜H⁺-ATPase的分生组织细胞是侧生根的前体，因此，质膜H⁺-ATPase的富集促进了侧生根的形成^[21]。Morozesk等^[22]也在试验中发现施用腐殖酸可显著提高H⁺-ATPase活性。另外，本研究还发现，NPKS处理的花生根系生物量显著低于其他处理，说明秸秆还田抑制了根系的生长发育，这可能是因为玉米秸秆在分解过程中产生的酚酸类物质会降低根系SOD酶活性，使根系活力下降，因而导致根系的生长被抑制^[23]。

在各处理下，¹³C丰度均呈现出地上部＞根系＞土壤的规律。安婷婷等^[12]通过对玉米进行脉冲标记，发现在标记1 d后和15 d后，同一处理下¹³C丰度均为茎叶＞根系＞根际土壤＞土体，本研究结果与此相似。Butler等^[24]人在黑麦草上进行的脉冲标记也呈现相似的结果。地上部、根系和土壤中的¹³C丰度在不同施肥处理下表现出一定的差异性，可能原因：①施肥方式影响花生的光合效率，不同施肥处理下花生的光合效率有差异^[25]；②施肥方式影响花生的生物量，若植株光合效率一致，则高生物量植株会使吸收的¹³C被稀释^[12]；③施肥方式影响花生植株和土壤的呼吸速率^[26]，致使标记的¹³C以不同的速率损失；④施肥方式影响植株的根际沉积^[27]，造成不同施肥处理下标记的¹³C从花生植株损失到土壤中的速率不同。例如，NPKS处理下土壤中的¹³C丰度显著低于其他处理，可能是因为秸秆中C元素含量很高^[28]，为土壤中的微生物提供了丰富的碳源，微生物对花生根际沉积碳的代谢减弱，如酚酸类物质的根际沉积碳在根系的富集对花生造成化感作用，抑制花生的生长发育，这种负反馈机制使花生的根际沉积速率下降^[29]。以上因素既有可能单独影响¹³C丰度，也有可能综合影响。因此，造成不同施肥处理下不同部位¹³C丰度差异的成因较为复杂，有待进一步探索。

植株同化的¹³C以及转运到土体中的¹³C会因为植株和土壤微生物的呼吸而损失掉一部分^[12]，被固定在植株和土壤中的¹³C总量与标记试验添加的¹³C总量之商为回收率。本试验中，¹³C的回收率为76.02%，与王群艳等^[30]在水稻上进行脉冲标记的回收率接近(不同生育期回收率在72.0% ~ 81.0%之间)，但是显著高于在玉米(不同生育时期回收率在38.65% ~ 64.01%之间)^[12]和黑麦草(不足50%)^[24]上进行脉冲标记的回收率。植物同化的光合碳通过根际沉积的方式部分转移到土壤中，为土壤微生物提供能量来源或者以有机物的形式存储在碳库中^[31]。花生同化的光合碳(¹³C)在本试验中向土壤中的转移比例平均为(34.92 ± 5.36)%，高于水稻(各生育时期平均20.3% ~ 21.2%，但抽穗期可达46.8% ~ 50.0%)^[11]和玉米(苗期标记15 d后不足4%)^[12]。这说明不同作物品种、同一作物品种的不同时期，光合碳向土壤中转移的比例具有很大差异。本试验中，3次标记分别在花生的开花下针前期、开花下针末期和结荚前期进行，但是并未分开取样以研究不同时期下光合碳(¹³C)在不同部位的分配比例，这需要在以后的研究中继续探索。地上部分固定的¹³C在不同处理之间差异不显著，但是NPKA处理的根系和土壤固定的¹³C均显著高于NPK，NPKA处理固定的总¹³C亦显著高于NPK。计算不同处理下光合碳(¹³C)在不同部位的分配比例也发现，NPKA处理地上部的分配比例显著低于其他3个处理，而土壤中的分配比例正好相反。这说明NPKA处理能显著提高花生光合碳(¹³C)向土壤中的转运。Canellas等^[32]通过玉米栽培试验发现，腐殖酸处理较常规施肥能提升根际分泌的草酸含量200%以上，柠檬酸含量提升150%以上，酒石酸含量提升300%以上。通过一系列试验和论证，Canellas和Olivares^[33]得出结论：腐殖质的施用会影响植株的初级代谢和次生代谢，改变植株的根际分泌物。Canellas等人的结论很好地解释了本试验中NPKA处理显著提升花生光合碳(¹³C)在土壤中的分配比例。腐殖酸的施用能显著提升花生光合碳向地下部(尤其是土壤)的转移，在农业生产中，施用腐殖酸是否亦能有效提升光合碳向荚果的转移，从而提升花生产量，需要在以后的研究中进一步验证。另外，花生光合碳经过根系分泌进入土壤以后的进一步转运，包括微生物的利用等过程，目前亦尚不明确，需要深入研究。

4 结论

本研究利用¹³C脉冲标记定量研究了不同施肥处理下光合碳在花生-土壤系统中的分配。发现不同施肥处理对标记期内花生总生物量影响不显著，但是NPKA处理显著提升了花生根系生物量。在各施肥处理下，¹³C丰度均为地上部＞根系＞土壤，¹³C含量及分配比例均为地上部＞土壤＞根系。NPKA处理地下部的¹³C含量及分配比例最高，说明施用腐殖酸能显著促进花生光合碳向地下部的转运。