随着我国工业化进程的加快，土壤重金属污染问题越来越严重。其中Cd的点位超标率为7.0%，是所有无机污染物中最高^[1]，且Cd是环境中生物毒性和迁移性最强的元素之一^[2]，易通过食物链被人体吸收，危害身体健康。因此，治理土壤Cd污染迫在眉睫。

植物修复技术(phytoremediation)是修复Cd等重金属污染土壤最具潜力的方法之一。该技术因同时具备治理效果的永久性、治理过程的原位性、治理成本的低廉性、环境美学的兼容性、后期处理的简易性等多项优点，而倍受青睐^[3-5]。但由于受到土壤重金属生物有效性等因素的制约，植物修复往往存在效率较低的问题^[6-7]。通过施用螯合剂能够显著地增加土壤重金属的生物有效性，从而提高植物修复效率^[8]。因此，利用螯合剂强化植物修复技术已成为新的发展趋势。

柠檬酸是一种天然螯合剂，能改变重金属Cd的形态并促进其释放，进而提高植物吸收和积累土壤中的Cd。大量研究表明，柠檬酸能够有效提高Cd污染土壤的植物修复效率^[9-10]。贾倩闻等^[11]研究表明，施加柠檬酸使海州香薷地上部Cd平均含量比对照增加了1.50倍。Sana等^[12]研究表明施加外源柠檬酸不仅可以增加植物对Cd吸收还能缓解Cd对植物的胁迫，并有利于促进超富集植物欧洲油菜对Cd的提取。本课题组研究发现，当柠檬酸的施加量为5 mmol/kg时对提高青葙各部分Cd含量的促进效果最佳^[13]。但由于施加时间和次数的不同，可能会导致柠檬酸对植物修复Cd污染土壤的促进效果存在差异。王学锋等^[14]研究表明，柠檬酸施加一周后，四川黄芥地上部对Cd的吸收并没有明显改善；然而景琪等^[15]研究表明，柠檬酸施加10 d后，商陆地上部对Cd的吸收促进效果显著，提高幅度为66.19%；张家伟^[16]研究表明，柠檬酸施加30 d后，巨菌草地上部Cd吸收量较空白提高了13.57%；而黎诗宏等^[17]研究表明，移栽后第15、22、30天时分别施加柠檬酸，移栽76 d后，龙葵地上部Cd吸收量较空白提高了179.74%。因此，本研究通过不同时间和等量分两次施加柠檬酸，探讨了以哪种方式施用柠檬酸对青葙地上部Cd积累量的促进效果最好，以期为青葙在Cd污染土壤的修复实践提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试土壤采自广西桂林，为Cd污染土壤，采集0 ~ 20 cm表层土壤。将采集的土壤样品放置阴凉处自然风干，剔除石子和枯叶等杂物，压碎后过2 mm尼龙筛，备用。取风干土壤样品，用TRF-2B型多功能土壤测试仪(仪器误差 < 3.0%)测定土壤基本理化性质(表 1)。

青葙种子采集于广西桂林上等元村。2017年4月8日，选取颗粒饱满的青葙种子播种于育苗盘中，置于温室培养，温室温度恒定在20℃ ~ 35 ℃。种子萌发后，每周用Hoagland’s营养液浇灌一次^[18]，平日使土壤含水量保持在田间持水量的80%左右。待幼苗长出4 ~ 6片真叶，高度约为3 ~ 4 cm时，移栽进行盆栽试验。

试验所用柠檬酸为分析纯柠檬酸。

1.2 试验设计与实施

盆栽试验于2017年4—7月在桂林理工大学重金属污染植物修复试验基地进行。准确称取1.5 kg的土壤装于规格为2 L(14.5 cm × 19 cm)的塑料盆内。选取生长一致的青葙幼苗移栽入盆中，每盆1株。培养期间，使土壤含水量保持在田间持水量的80%左右。试验共设10个处理，3次重复，分别是：①CK：种植青葙，施加等量去离子水；②CA+Bal：种植青葙，移栽幼苗前两周施加柠檬酸，充分混匀后加水并晒干，如此反复3次；③CA+4：种植青葙，在第4周(2017年4月29日)时(以育苗当天作为第1周)施加柠檬酸；④CA+4/5：种植青葙，在第4、5周时等量分两次施加柠檬酸；⑤CA+5：种植青葙，在第5周时施加柠檬酸；⑥CA+5/6：种植青葙，在第5、6周时等量分两次施加柠檬酸；⑦CA+8：种植青葙，在第8周时施加柠檬酸；⑧CA+8/9：种植青葙，在第8、9周时等量分两次施加柠檬酸；⑨CA+10：种植青葙，在第10周时施加柠檬酸；⑩CA+10/11：种植青葙，在第10、11周时等量分两次施加柠檬酸。仅CA+Bal处理柠檬酸以粉末形式加入并搅拌均匀，其余处理柠檬酸溶于去离子水，以溶液形式施于土壤表面，总施加量为5 mmol/kg。植物在第12周末(2017年7月1日)收获。

1.3 样品处理和分析测定

植物收获时，抖落松散黏附在根系表面1 ~ 4 mm范围内的土壤作为根际土^[19]，置阴凉处自然风干，压碎后过200目筛，备用。样品采用USEPA推荐的HNO₃-H₂O₂法^[20]消解，有效态Cd采用DTPA浸提法浸提，并用电感耦合等离子体发射光谱仪(PerkinElmer Optima 7000 DV)测定样品中Cd含量。分析过程中所用试剂均为优级纯，采用国家标准土壤样品(GBW07404(GSS-4))和平行空白样进行土壤样品消解及质量控制，样品回收率为90% ~ 110%。收获的植物分成根、茎、叶3部分。根部先用5 mmol/L Ca(NO₃)₂溶液浸泡15 min，交换掉表面吸附的重金属Cd^2+[21]，然后超声波清洗仪清洗10 min，再用去离子水冲洗干净。茎和叶先用自来水冲洗掉表面的尘土，再用去离子水冲洗干净。洗净的植物样品在105 ℃下杀青30 min，70 ℃下烘干至恒重(48 h)。烘干后的样品用电子天平称量生物量(以干重计)，粉碎，过5 mm筛，供分析测定用。称取粉碎的样品(约0.2 g)用HNO₃+HClO₄(9:1)湿法消解，采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定样品Cd含量。分析过程中所用试剂均为优级纯，采用国家标准参比物质(GBW07602 (GSV-1))和平行空白样进行植物样品消解及质量控制，样品回收率控制在95% ~ 105%。

1.4 数据处理与统计

统计分析采用SPSS19.0中的单因素方差(ANOVA)，并用最小显著差数法(LSD)进行显著性检验(P < 0.05)，用Origin 9.1作图。Cd的富集系数(BCF)和转运系数(TF)的计算公式如下：

富集系数(BCF)=植物叶Cd含量(mg/kg)/土壤Cd含量(mg/kg)

转运系数(TF)=植物叶Cd含量(mg/kg)/植物根Cd含量(mg/kg)

2 结果与分析 2.1 柠檬酸不同施用方式对根际土pH的影响

柠檬酸不同施用方式对根际土pH影响见图 1。施加柠檬酸后，所有处理青葙根际土的pH均略有降低，且CK的根际土pH低于中性土的下限值(pH = 6.5)，说明青葙的根际环境应为酸性。CA+Bal处理的pH高于其他柠檬酸处理，这可能是由于柠檬酸以粉状形式加入土壤并搅拌均匀，对土壤pH的影响较小，而其他处理均以溶液形式施于根际表面土壤，故对于根际土的pH影响更大。

2.2 柠檬酸不同施用方式对根际土有效态Cd含量的影响

柠檬酸不同施用方式对根际土有效态Cd含量的影响见图 2。所有处理根际土有效态Cd含量没有显著变化，这可能是由于岩溶区土壤Ca含量高，酸中和能力强，施加的柠檬酸被中和了，未能有效提高土壤有效态Cd含量。

2.3 柠檬酸不同施用方式对青葙各部分生物量的影响

柠檬酸不同施用方式对青葙叶、茎、根及地上部生物量的影响如图 3所示。不同时间施加柠檬酸，所有处理各部分生物量均有所增加，这可能是由于柠檬酸与土壤中的Cd²⁺螯合，这与魏佳等^[22]研究结果一致：柠檬酸主要贡献为官能团的螯合作用，使Cd²⁺转化为无毒或毒性更小的结合形态，从而减小了对青葙的胁迫能力，更有利于青葙生长发育。其中，CA+Bal处理各部分生物量均最大，叶、茎、根及地上部分别比对照增加了66.18%、67.22%、65.58%和66.92%。不同次数施加柠檬酸对各部分生物量的变化趋势相同，均是等量分两次施加处理对青葙生长的促进作用优于单次施加处理，这可能是由于多次施加可以降低柠檬酸对植物的生理毒害作用，并逐渐增强植物对柠檬酸的耐受性^[23]。青葙各部位间生物量大小均表现为：茎 > 叶 > 根。

2.4 柠檬酸不同施用方式对青葙各部分Cd含量的影响

柠檬酸不同施用方式对青葙叶、茎、根和地上部Cd含量的影响如图 4所示。随着柠檬酸施加时间的推进，青葙各部分Cd含量呈先增加后减少的趋势，且均在CA+4、CA+4/5处理时含量最大，CA+4处理的叶、茎、根和地上部干重分别比CK处理高117.76%、45.71%、64.79%和67.18%，CA+4/5处理各部分分别比CK处理高102.47%、73.40%、96.12%和66.82%，说明第4周和第4、5周施加柠檬酸对青葙各部分Cd含量的促进作用最大。CA+Bal处理各部分Cd含量显著高于CK处理，但显著低于CA+4和CA+4/5处理，这可能是由于小分子有机酸易生物降解，在移栽之前已经有部分柠檬酸被土壤中的微生物降解，导致对青葙体内Cd含量的促进作用没有CA+4和CA+4/5处理好。同样的，等量分两次施加柠檬酸处理的Cd含量比单次施加略大，单次施加大量的柠檬酸中有一小部分被生物降解，而等量分两次施加对重金属Cd的活化效果更持久，所以对青葙各部分Cd含量的促进效果比单次施加好。

2.5 柠檬酸不同施用方式对青葙富集系数和转运系数的影响

富集系数被用来反映土壤-植物体系中元素迁移的难易程度，是植物将重金属吸收转移到体内能力大小的评价指标^[24]。从表 2可以看出，柠檬酸的施加提高了青葙的富集系数，说明柠檬酸的施加有利于青葙对重金属Cd的富集吸收。随着施加时间的推进，富集系数先增大后减小，CA+4和CA+4/5处理的富集系数最大。

转运系数用来评价植物将重金属从根部向地上部运输和富集的能力^[24]。除了CA+5/6、CA+8/9、CA+10、CA+10/11处理，其余处理的转运系数均大于CK，可能是由于CA+5/6、CA+8/9、CA+10、CA+10/11处理的柠檬酸施加时间较晚，青葙对Cd的吸收部分积累在根部，没有转运至地上部，故转运系数小于对照。

2.6 柠檬酸不同施用方式对青葙地上部Cd积累量的影响

地上部Cd积累量=叶生物量×叶Cd含量+茎生物量×茎Cd含量，由此计算出的青葙地上部Cd积累量见图 5。随着施加时间的推进，柠檬酸处理地上部Cd积累量逐渐减小，这与曹志远等^[25]研究发现螯合剂在土壤中存留时间长有助于提高植物对重金属的富集能力相一致。CA+Bal和CA+4/5处理地上部Cd积累量显著高于其他处理，分别比CK高139.62%和129.59%。因此在移栽前施加柠檬酸，混匀后平衡两周和第4、5周等量分两次施加柠檬酸最适合用于强化青葙修复Cd污染土壤。对于不同次数施加柠檬酸，等量分两次施加柠檬酸的处理均比对应单次施加的大，分别增加了8.3%、36.31%、32.13%、23.89%，说明等量分两次施加柠檬酸更有利于青葙对Cd吸收富集。

3 讨论

CA+Bal处理青葙地上部生物量比CA+4和CA+ 4/5分别增加了32.9%和21.8%，这是因为CA+Bal处理是移栽前施加柠檬酸，混匀后平衡两周，部分柠檬酸被生物降解，柠檬酸对青葙的生理毒害效应减弱，这与沈斌等^[26]研究结果一致，即低浓度柠檬酸对鱼腥草没有产生明显的生理毒性，反而促进了鱼腥草的生长发育，但高浓度柠檬酸的施加对鱼腥草有明显的生理毒性，导致鱼腥草生物量降低；另一方面CA+Bal处理中青葙各部分Cd含量高于对照，但显著低于CA+4和CA+4/5处理，可能由于柠檬酸容易被土壤中的微生物降解^[27]，而CA+4和CA+4/5处理是在植物生长期以溶液形式施于土壤，更多的柠檬酸以重金属Cd的络合物进入青葙体内，因此CA+4和CA+4/5处理青葙体内Cd含量更高。

姚诗音等^[28]研究发现，当青葙生长到第8周以后地上部Cd积累量无显著增加，是Cd积累量最多的时候。CA+8和CA+10处理施用时间处在青葙地上部Cd积累量较大时，这时外源施加柠檬酸，与土壤固相结合在一起的重金属Cd与柠檬酸结合成金属络合物进入到土壤溶液中^[29-30]，进一步促进了青葙对Cd的吸收，但会加剧青葙的中毒，加速青葙的落叶，导致富集了大量重金属Cd的叶片又重新回到土壤，造成二次污染。张磊等^[31]在收获前一周施加螯合剂，在加入螯合剂的第4天，EDTA(7.5 mmol/kg)处理的叶片开始出现脱落症状直至第5天全部脱落，本研究结果与此一致。曹志远等^[25]研究表明螯合剂在土壤中存留时间长有助于提高植物对重金属的富集能力，这与本研究中CA+8和CA+10处理由于施加时间较晚，柠檬酸对地上部Cd含量的增加量相对较少一致。因此不建议在收获前施加柠檬酸。

研究表明多次施加螯合剂可以降低螯合剂对植物的毒害作用，并逐渐增强植物对螯合剂的耐受性^[25]。在本研究中等量分两次施加柠檬酸处理的地上部生物量均大于单次施加柠檬酸处理，这正佐证了前人的观点。研究表明螯合剂分两次淋洗时淋出的重金属量显著大于单次淋洗^[32]，说明两次施加柠檬酸对重金属的持续活化效果更好，本试验也发现等量分两次施加柠檬酸处理的青葙地上部Cd含量大于单次施加。故等量分两次施加柠檬酸处理优于单次施加柠檬酸的处理。

植物修复收获的是植物地上部分，青葙地上部Cd积累量表征了青葙的修复潜力。地上部青葙Cd积累量表明，CA+Bal和CA+4/5处理均可作为柠檬酸强化青葙修复Cd污染土壤的最佳施用方式。考虑到CA+Bal处理柠檬酸要与土壤平衡两周，消耗时间较久；而CA+4/5处理中柠檬酸以溶液形式喷洒(柠檬酸溶解度为20 ℃时59.2%)，对于大规模土壤修复，需要大量的水溶解柠檬酸，由此消耗的人力比CA+Bal处理大。故需要结合实际修复情况进行选择：若修复工程工期紧，则可考虑CA+4/5处理；若考虑成本的低廉、工序的简易，则可以选择CA+Bal处理。

随着对植物修复强化措施研究的深入，人们对于强化措施效果的评价不再只局限于超富集植物的修复效率，土壤环境质量也成为关注的热点。其中土壤酶活性和微生物多样性是简单易行且可靠的土壤环境质量评价指标。一方面，为了研究柠檬酸对土壤酶活性的影响，赖彩秀^[33]向Cd、Zn污染土壤中施加柠檬酸，发现柠檬酸提高了土壤脲酶和蔗糖酶的活性；邢艳帅^[34]研究表明，低浓度柠檬酸增强了土壤淀粉酶和过氧化氢酶活性，施加柠檬酸浓度分别为3 mmol/kg和4 mmol/kg时，土壤中淀粉酶和过氧化氢酶的活性分别达到最大值；丁玲^[35]在铅锌镉污染土壤中施加柠檬酸后也发现，土壤的脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性明显增加。这可能是柠檬酸与重金属进行络合形成毒性较低的络合物，降低重金属对土壤微生物的毒害，从而改善土壤的环境质量^[36-37]。另一方面，对于微生物多样性，丁玲^[35]研究表明，在铅锌镉污染土壤中施加柠檬酸，可使土壤中细菌的种群产生显著差异，其中土壤中变形菌门菌属显著增加。变形菌门是重金属污染土壤中超富集植物根际的主要种群，在超富集植物对重金属的吸收和耐性中发挥重要作用。由此可见在土壤中施加柠檬酸对植物根际微生物具有一定的筛选作用，使土壤中不利于活化的种群消失，而利于植物生长和重金属活化的微生物种群数量显著提高。因此，施加柠檬酸不仅有利于提高土壤酶活性而且可引起土壤微生物特殊种群的形成并可能导致稳定遗传现象的产生，从而改善土壤的环境质量。综上，外源施加柠檬酸可作为强化措施，既能提高修复效率又能改善土壤的环境质量。

4 结论

1) 移栽前施加柠檬酸，混匀后平衡两周种植的青葙各部分生物量均最大。而在收获前施加柠檬酸，会加速青葙叶片的枯萎、凋落，从而降低青葙的生物量，不利于提高土壤的修复效率。

2) 等量分两次施加柠檬酸处理优于单次施加柠檬酸的处理。

3) 移栽前施加柠檬酸，混匀后平衡两周的处理和第4、5周等量分两次施加柠檬酸处理更适合强化青葙修复Cd污染土壤，提高青葙对Cd污染土壤的修复效率。