2. 中国科学院大学,北京 100049
稻田水土界面之间的微生物通常以稻田自然生物膜的形式存在。自然生物膜是在自然环境条件下形成于淹水基质表面的微生物聚集体及其交织的非生物物质的集合体。微生物包括细菌、真菌、原生动物、藻类、病毒等;非生物物质包括微生物分泌的多糖、蛋白质、脂类等有机质以及铁锰氧化物、碳酸盐、硅酸盐等无机矿物质[1]。稻田自然生物膜覆盖于土壤表面,是外源污染物如重金属离子进入土壤的必经之地,是多种物质包括养分、重金属重要的存储库以及传输介质[2]。大量研究发现自然生物膜是水体中重要的短期磷库,也对富营养化水体-底泥界面无机磷的缓存和缓释起着重要的调控作用[3]。而且,自然生物膜,作为一种微生物聚集体,还可以分泌多种水解酶,对土壤和底泥中有机磷的降解和生物有效性等起着促进作用[4]。
当前,由于工业废物排放、污水灌溉以及含有重金属的农药、化肥的不合理使用等,许多污染物包括过量的重金属离子不断进入稻田生态系统。这些重金属污染可对稻田水土界面中的微生物产生毒害,阻碍了碳氮循环、代谢活性、酶活性等各种微生物过程[5]。自然生物膜在水环境中对重金属的迁移、生物地球化学特性、生物可利用性和毒性等过程中,均起着非常重要的作用[6]。关于自然生物膜和金属之间的相互作用进行了较多的研究,Dong等[7-9]发现自然生物膜对Pb、Cd、Cu、Zn等重金属有很强的吸附作用。Serra等[10]报道了河流系统中自然生物膜群落对水体金属Cu暴露的响应,分析表明自然生物膜中重金属含量如Cd (Ⅱ)和水体Cd (Ⅱ)浓度的变化一致,具有较高的相关性。一些研究也表明水体中存在许多光合物种,如蓝藻Chlamydomonas具有强烈的吸收金属元素的能力。这些研究均表明自然生物膜具有较大潜在富集水体中金属元素的能力[11]。但重金属离子对稻田自然生物膜的磷酸酶活性的影响研究还极少涉及。
自然生物膜包含多种磷酸酶,如磷酸单酯酶、磷酸二酯酶、聚磷酸酶等,其中磷酸单酯酶活性最高、分布最广泛。已有研究证明覆盖于淹水基质表面的自然生物膜能够释放磷酸单酯酶来水解环境中的有机磷,这是提高环境中磷有效性的重要途径[12]。磷酸单酯酶是广泛存在于微生物中的一种金属酶,其构象及活力受到金属离子的影响[13],而且金属离子对磷酸酶基因的表达也受其种类和浓度等影响[14]。目前关于金属离子对于稻田自然生物膜磷酸酶活性影响的研究很少,因此本文研究了部分金属离子对稻田自然生物膜酸性磷酸单酯酶(ACPase)和碱性磷酸单酯酶(ALPase)活性及酶动力学参数的影响,以期揭示金属离子与自然生物膜磷酸酶的作用机制,为稻田磷的生物地球循环过程的认识和重金属污染的风险评估提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 自然生物膜富集与培养在南京江宁区水稻田采集土壤溶液于自制玻璃缸(长×宽×高=30 cm × 20 cm × 50 cm)中,并将纤维载体淹没其中。每周添加BG-11营养液[15],以充分维持生物膜的生长。将水缸置于人工气候室中,光/暗周期为14 h(26 ℃)/10 h(20℃),光强度为12 000 lux,湿度为80%。一个月后,微生物聚集体附着在载体上,形成稳定的生物膜。从玻璃缸中收集在纤维载体上附着的生物膜,并用于后续试验。采用光学显微镜(Nilcon-80i,Japan)和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM,Zeiss-LSM710,German)对周生生物膜的形态进行表征。
1.2 试验设计用磷酸单酯酶标准底物对硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP)来测定酶活性。不同金属离子的选取如下:K+、Na+、Ca2+选取相对应的可溶性氯化盐,Mg2+、Co2+、Al3+、Mn2+、Ni2+和Zn2+选取可溶性硫酸盐,Cu2+和Ag+选取可溶性硝酸盐, 用K2Cr2O7作为Cr6+的来源。Tris-HCl缓冲溶液被用于控制体系pH。将100 ml生物膜悬浮液在15 ℃下1 157 g离心10 min后移除上清液,用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(酸性条件为pH 6.0,碱性条件为pH 9.0)重新悬浮生物膜样品,离心和洗涤过程重复两次,尽可能减少培养基质中本身携带离子的含量。将生物膜再悬浮于100 ml的0.05 mmol/L Tris-HCl缓冲液中,用于后续试验。
1.2.1 不同离子对磷酸酶活性的影响依据稻田土壤中各种离子的有效态含量以及重金属污染对土壤酶活性的影响研究[16],在50 ml离心管中加入不同浓度的金属离子溶液5 ml,控制金属离子最终浓度为0、0.1、0.25、0.5、1.0 mmo/L,以测试其对磷酸酶活性的影响。按照相当于0.4 g/L干物质量的比例加入清洗后的生物膜悬液2 ml,统一用水定容至12 ml后在25 ℃,200 r/min的避光条件下振荡2 h。然后加入5 ml的0.2 mol/L Tris- HCl缓冲液和2 ml的10 mmol/L pNPP溶液(终浓度为1 mmol/L),在37 ℃、200 r/min的避光条件下继续振荡1 h, 立即加入1 ml的0.5 mol/L NaOH终止水解反应。过滤后将滤液在405 nm下测定吸光度。每个处理设定3个重复。以不加上述金属离子体系中的生物膜酶活性为100,其余条件下测定的酶活性与未加金属离子条件测得酶活性相比得到相对酶活性。
1.2.2 不同离子影响下磷酸酶活性的动力学分析选取不同浓度的Mg2+、Zn2+和Cu2+(0、0.25、0.5、1.0 mmol/L)溶液,测定其对磷酸酶动力学参数的影响,pNPP浓度范围为0 ~ 1 500 mmol/L。酶的催化速度随着底物浓度的增加而增加,直到接近最大速度(Vmax)的某一点。酶催化的反应动力学通常用符合米氏方程(Michaelis-Menten方程),其中米氏常数(Km)是速度达最大速度一半时的底物浓度;米氏常数表明酶对底物的亲和力:Km越低,亲和力越高。这些参数由Michaelis-Menten方程描述:
$ V = \frac{{{V_{\max }}\left[ S \right]}}{{\left[ S \right]}} + {K_{\rm{m}}} $ | (1) |
式中:V 是任意时刻酶催化反应的速度(μmol(g·h));S 是相应时间的底物浓度(mmol/L);Vmax是最大催化反应速率(μmol(g·h));Km是米氏常数(mmol/L)。动力学参数Vmax和Km使用Michaelis-Menten方程的线性变换Hanes-Woolf方程计算:
$ \frac{{\left[ S \right]}}{V} = \frac{{\left[ S \right]}}{{{V_{\max }}}} + \frac{{{K_m}}}{{{V_{\max }}}} $ | (2) |
本研究每组试验重复3次,结果以平均值±标准误差表示。采用Microsoft Excel 2016以及数据进行统计、制图;采用SPSS中Duncan法对数据进行差异显著性分析,P < 0.05表示差异显著。
2 结果与讨论 2.1 自然生物膜形态表征采用光学显微镜(Nilcon-80i,Japan)和激光共聚焦扫描显微镜(CLSM,Zeiss-LSM710,German)对自然生物膜的形貌进行了表征(图 1)。结合文献[17]分析,发现自然生物膜主要由光自养微藻,尤其是丝状藻类组成。丝状藻类交织在一起,很多细菌、真菌、原生动物和小型多细胞动物等附着在丝状藻类上面。
金属离子对自然生物膜中ACPase和ALPase活性影响的结果表明,影响的方式有4种:抑制型、激活型、相对无害型和混合型(表 1)。正一价碱金属离子(K+和Na+)在0 ~ 1.0 mmol/L浓度范围内均对ACPase和ALPase无明显影响(P > 0.05),属于相对无害型。Ca2+可以提高ACPase和ALPase的活性,在0.1 ~ 1.0 mmol/L浓度范围内最大可提高磷酸酶的活性达14%(P < 0.05)。Mg2+对ACPase和ALPase活性均有显著的激活效应,随着离子浓度的增大,ACPase和ALPase活性不断增强;在Mg2+浓度1.0 mmol/L时,酶活性最大可提高54%,属于激活型。Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+对ACPase和ALPase活性均有显著抑制作用(P < 0.05),属于抑制性;抑制剂浓度达到1.0 mmol/L时,最大抑制率可达85%。但是这些离子对于ACPase和ALPase活性的抑制程度不同,Cu2+、Al3+对ACPase活性的影响明显大于ALPase,而Zn2+对ALPase活性的影响明显大于ACPase。Ni2+、Ag+在低浓度(0.1 mmol/L)时对ACPase活性无明显影响,随着离子浓度的增加,ACPase和ALPase活性降低。Co2+在低浓度时对ACPase和ALPase活性有一定的激活作用,随着浓度的增大,变为抑制作用,属于混合型。Cr6+在低浓度(0.1 mmol/L)时对ACPase活性有促进作用,而在离子浓度0.25 ~ 1.0 mmol/L的范围内,均对ACPase活性产生抑制作用,当Cr6+离子浓度达到1.0 mmol/L时,生物膜已丧失ACPase活性。而Cr6+对ALPase活性具有激活作用,随着离子浓度的增大,ALPase活性不断增加。
磷酸酶是一种金属酶,其酶活性的充分发挥需要两种金属离子:Mg2+和Zn2+,其中Zn2+位于酶活性中心,是酶活性必需基团之一,Mg2+对酶活性的表达起到重要作用[18];而Cu2+是土壤污染的几种主要重金属之一。所以选取Mg2+、Zn2+和Cu2+对磷酸酶的动力学常数(Km和Vmax)进行探讨。图 2中显示了在Mg2+、Cu2+和Zn2+存在下,酶反应动力学变形方程的Hanes-Woolf曲线,[s] / V和[s]拟合方程的截距和斜率与不添加金属离子的处理不同,说明金属离子对生物膜磷酸酶活性产生了影响。拟合得出的Km和Vmax值表明(表 2),无金属离子加入下自然生物膜ACPase的Km值为164.58 μmol/L,Vmax值为pNP 138.89 μmol/(g·h),而ALPase的Km值为76.90 μmol/L,Vmax值为pNP 256.41 μmol/(g·h)。可知自然生物膜ALPase与底物的亲和力与催化效率都强于ACPase。随着Mg2+浓度的增加,ACPase的Km值降低,Vmax值增大,说明Mg2+的加入使ACPase与底物的亲和力与催化效率增强;而ALPase的Km值变化不大,Vmax值增大,说明Mg2+的加入主要使ALPase催化效率增强。Cu2+的加入(1.0 mmol/L条件下ACPase完全失活,无法拟合)对ACPase的Km值无明显变化,而Vmax值不断下降,所以Cu2+对ACPase的抑制作用可认为是非竞争性抑制作用;在低浓度条件下(0 ~ 0.25 mmol/L),Cu2+的加入对ALPase的Km值无明显变化,而Vmax值下降,也可认为是非竞争性抑制作用,而在高浓度范围下(0.25 ~ 1 mmol/L),Km值增大,Vmax值降低,所以Cu2+在高浓度下同时降低了ALPase的亲和力和催化效率,属于混合型抑制作用。Zn2+的加入均降低了ACPase的Km值和Vmax值,表明Zn2+虽然提高ACPase与底物的亲和力,但是降低了ACPase的催化速度。在低浓度范围(0 ~ 0.25 mmol/L),Zn2+对ALPase的作用效果与ACPase类似,同时降低了Km值与Vmax值。在较高浓度范围(0.25 ~ 1 mmol/L),随着Zn2+浓度的升高,Km值升高,Vmax值降低,Zn2+同时降低了ALPase与底物的亲和力与催化效率。
由图 1可以看出,自然生物膜主要是丝状藻等光合藻类为主导的物种相互缠绕而构成自然生物膜的基质,而其他生物栖息于此基质上。许多微生物共存于自然生物膜中,意味着自然生物膜是一个有别于单一微生物种群的复杂微生态系统。在自然生物膜这种非均相体系中,金属离子、胶体、微生物和酶之间的复杂反应都有可能干扰任何金属离子对于磷酸酶的影响。已有研究证明自然生物膜通过本身这种复杂特殊的组成结构可能使其在抵抗外源污染物时,具有有别于简单微生物种群的性质,由于自然生物膜能够承受一定的金属离子胁迫而不会严重丧失其生物化学活性[19]。一些关于稻田自然生物膜的研究表明,自然生物膜能够适应一定浓度的重金属污染,而胞外聚合物的吸附、群落中藻类丰度提高和组成变化导致碳代谢活性功能的响应,是自然生物膜能够适应重金属胁迫的主要原因[20]。本文中生物膜磷酸酶活性对重金属的敏感性远低于麦芽中磷酸酶的,如0.5 mmol/L的Cu2+和Zn2+抑制生物膜酸性的活性约40%,而同样浓度的Cu2+和Zn2+使麦芽中磷酸酶的活性降低80%以上[21]。活性污泥中微生物和介质环境更加复杂,因此0.5 mmol/L的Cu2+和Zn2+仅使活性污泥的磷酸酶活性降低约15%[22]。
金属离子对酶活性的影响可表现为对酶蛋白的作用,一般分为3种类型[16]:①一些金属离子的加入可以促进酶活性中心与底物间的配位结合,改变酶蛋白的表面电荷以及催化反应的平衡性质,从而增强酶活性,即有激活作用。②一些金属离子占据了酶的活性中心或与酶分子的巯基、胺基和羧基结合,导致酶活性降低,即有抑制作用。③重金属与酶没有专一性对应关系,对酶活性影响小。而且,金属离子还会影响磷酸酶基因的表达[14]。如细菌碱性磷酸酶的种类多样,根据碱性磷酸酶蛋白序列的相似度和底物的不同,可主要分为3种类型:phoA,phoX 和phoD。由于Zn2+与Mg2+是碱性磷酸酶phoA 的辅基,一定浓度的Zn2+与Mg2+的存在会促进细菌phoA 基因的表达;而一定浓度的Ca2+和Co2+能重新促进phoX 基因的表达[14]。因此,一定浓度的某些金属离子通过促进磷酸酶基因的表达,促进磷酸酶活性,但这种作用与金属离子的种类、浓度和磷酸酶基因的类型有关。但浓度过高时,则会因毒害作用而抑制酶活性表达。
我们的研究表明,正一价碱金属离子(Na+和K+)对磷酸酶活性无明显影响,这一发现与Chen等[23]的发现一致,说明Na+和K+对稻田自然生物膜磷酸酶没有对应关系。Mg2+促进了ACPase和ALPase酶活性,因为其是磷酸酶中心结合位点的调节离子,加入能够促进酶活性中心与底物间的配位结合,来改变酶催化反应的平衡性和酶蛋白的表面电荷,从而可增强酶活性[18]。Mg2+也是磷酸酶的辅基,并促进磷酸酶功能基因的表达[14],因此在0 ~ 1.0 mmol/L范围内显著提高了酸性和碱性磷酸酶活性。Ca2+、Co2+在一定条件下也能够提升酶活性,Wu等[24]研究发现加入一定浓度Ca2+、Co2+后能促进磷酸酶phoX基因的表达。但Ca2+、Co2+其对磷酸酶活性的激活作用明显低于Mg2+。Cr6+在酸性条件下抑制磷酸酶活性,在碱性条件下激发磷酸酶活性,这可能与Cr6+在不同pH条件下Cr6+的离子形态及其对藻类的毒性效应不同有关[25]。Zn2+、Cu2+、Mn2+、Al3+、Ag+对磷酸酶表现出了抑制作用,尤其是Zn2+、Cu2+、Mn2+,可能是这些重金属离子占据了酶的活性中心或与酶分子的巯基、胺基和羧基等基团结合导致酶活性降低甚至失活即有抑制作用[16],甚至直接毒害生物膜中的微生物,使其丧失生命力[5]。通常来说,酸碱度是影响藻类或细菌磷酸酶活性的重要因子,我们的研究发现自然生物膜的ALPase具有比ACPase更高的酶活性,这可能是由于自然生物膜属于光营养性微生物聚集体,其光合作用导致微域环境呈碱性条件[26],并适应该碱性环境,酸性条件一定程度上抑制了微生物的生命活力。
通常来说,抑制剂对酶促反应的作用可分为[27]:①竞争性抑制:竞争性抑制是指当抑制物与底物的结构类似时,它们将竞争酶的同一可结合部位,阻碍了底物与酶相结合,导致酶催化反应速率降低。这种抑制使得Km增大,而Vmax不变。②非竞争性抑制:抑制剂与酶的非活性部位相结合,形成抑制物-酶的络合物后会进一步再与底物结合;或是酶与底物结合成底物酶络合物后,其中有部分再与抑制物结合。虽然底物、抑制物和酶的结合无竞争性,但两者与酶结合所形成的中间络合物不能直接生成产物,导致了酶催化反应速率的降低,这种抑制使得Vmax变小,但Km不变。③反竞争性抑制:抑制剂不直接与游离酶相结合,而仅与酶-底物复合物结合形成底物-酶-抑制剂复合物,从而影响酶促反应的现象。这种抑制作用使得Vmax、Km都变小,但Vmax/Km比值不变。Mg2+同时降低了ACPase和ALPase的Km值,说明其有助于提高生物膜磷酸酶与底物结合的能力。Cu2+对ACPase的非竞争性抑制作用说明Cu2+可能与ACPase的非活性部分结合,或与酶促反应中的中间产物络合物结合并阻止产物生成,使酶的催化活性降低。而Zn2+对于磷酸酶以及Cu2+对于ALPase的抑制作用并不符合竞争抑制性、非竞争抑制性或反竞争性抑制性作用,可能是直接对生物膜产生了毒害作用。通常来说,在土壤、植物、活性污泥或动物粪便中的酸性或碱性磷酸酶动力学常数Km值是相似的,在0.2 ~ 0.8 mmol/L之间,而我们的研究发现自然生物膜的磷酸酶的Km值在0.1左右,即使在金属离子的影响下,Km值仍小于0.2,说明自然生物膜的磷酸酶对底物有更强的亲和力,而且这种亲和力受金属离子的影响相对较小。而酶动力学常数Vmax值通常随着所研究的材料的生物量浓度或不同物质的富集程度而显著变化,例如,各种磷酸酶的Vmax值在植物材料中比在土壤、动物粪便和污水污泥中大得多。对Vmax值产生显著影响的抑制剂浓度也会有很大差异。例如,Cu2+对活性污泥中碱性磷酸酶的抑制模型与土壤中游离和固定化酸性磷酸酶的抑制模型相似,但Cu2+对活性污泥中碱性磷酸酶的抑制浓度(0.1 ~ 2.5 mmol/L)明显高于土壤的(0.1 ~ 0.4 mmol/L)。这可能是由于活性污泥中生物量或磷酸酶的浓度较高[22]。而我们研究的稻田自然生物膜的生物组成可能与活性污泥中微生物群落的复杂性更加相似。
4 结论1) 不同金属离子对稻田自然生物膜酸性或碱性磷酸酶具有不同的作用,有可能抑制、激活或无明显作用,这种作用因金属离子的种类、浓度和磷酸酶类型而异。
2) 金属离子影响自然生物膜中磷酸酶活性,主要通过改变酸性或碱性磷酸酶与底物的亲和力和催化效率,以及影响磷酸酶基因的表达实现的。
3) 自然生物膜中磷酸酶对底物有很强的亲和力,金属离子对这种亲和力的影响较小。而且由于自然生物膜本身是一个复杂的微生态系统,因此抵御金属离子毒性的作用也明显强于单一微生物种群。
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