2020, Vol. 52
2. 湖南省灌溉水源水质污染净化工程技术研究中心，长沙 410128
细菌是土壤中数量最多、分布最广泛的微生物种群，可占土壤微生物总量的70% ~ 90%[1-2]。细菌及其胞外分泌物(extracellular polymeric substances，EPS)包括糖类、蛋白质、核酸和脂质等组分，富含大量官能团[3]，因此对微量金属元素有很强的吸附能力，并能进一步调控其生物地球化学循环过程[4]。近年来，土壤重金属污染问题日益突出，而微生物在污染土壤修复领域具有很大的潜力和应用前景[5-6]。为进一步制定合理的微生物修复策略，必须深入理解重金属元素在细菌表面的吸附和固定机制[7]。
关于细菌对阳离子如Cd2+、Pb2+、Cu2+的吸附研究已有很多报道。学者普遍认为，细胞壁和EPS表面的羧基、磷酸基、胺基、巯基和羟基等含氧官能团是最主要的吸附位点[8-10]。这些官能团的解离常数(pKa)不同，因此在不同pH下对重金属的吸附贡献有较大差异，如Boyanov等[11]报道在pH < 4.4时，磷酰基发挥主导作用，随着pH升高，羧基的作用更大。此外，重金属浓度也影响吸附过程，在低浓度时Cd优先结合在巯基上，在中高浓度时Cd主要结合在羧基和磷酸基上[12]。
相较于研究较多的金属阳离子，关于As、Sb等类金属元素在细菌表面吸附的研究还很缺乏。这主要是因为As、Sb在环境中多以含氧酸根形式存在，与细菌存在静电斥力，因此吸附量少，机理表征难度大。但少数研究发现As(Ⅲ, Ⅴ)可与红球菌(Rhodococcus sp.)和节杆菌(Arthrobacter sp.)的羧基、羟基和氨基发生部分络合反应[13-14]。
重金属往往以复合污染形式存在[15]，由于元素特性截然相反，重金属和类金属的复合污染原理非常复杂，治理难度更大。在我国南方污染区，Cd、As复合污染最为典型[16-18]，因此有必要理清Cd、As在土壤胶体界面的共吸附特点和机制。但近年来研究多关注纯矿物体系[19-21]，缺乏Cd、As在微生物体系共吸附行为的认识。
本研究选取一株土壤细菌Delftia sp.[22]，该细菌筛选自Cd、As复合污染土壤，通过批吸附试验、电位滴定及X-射线光电子能谱探讨Cd(Ⅱ)、As(Ⅴ)在细菌表面的共吸附特点和机制，探究是否存在协同或竞争作用，明确Cd、As结合官能团。本研究结果对于预测Cd、As在土壤微界面的化学行为有一定指导意义，为污染土壤的生物修复提供一定理论支撑。
1 材料与方法 1.1 土壤细菌本研究所用细菌为一株革兰氏阴性土壤细菌Delftia sp.[22]，分离自湖南省株洲市霞湾地区某冶炼厂周边表层土壤(0 ~ 20 cm，pH约为6.5)。该土壤为多金属复合污染，Cd、As浓度高达253和147 mg/kg。细菌采用Luria-Bertani营养基(酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L，pH约为7)进行扩大培养至指数后期，离心(4 000 g)收集菌体，并用0.01 mol/L NaCl电解质洗涤3次后悬浮。取1 ml细菌悬液，在60 ℃烘箱中烘干直至恒重，计算细菌悬液的浓度(mg/L)。
1.2 批吸附试验Cd、As母液分别由Cd(NO3)2·4H2O和Na3AsO4 (分析纯)配置。批吸附试验在一系列50 ml塑料离心管中进行：依次加入一定体积的细菌、重(类)金属和电解质(0.01 mol/L NaCl)溶液，控制总体系为30 ml，最终细菌浓度为0.1 g/L，金属浓度为0.2 mmol/L。设置3个体系：单一Cd、单一As以及Cd-As复合(摩尔比为1)。将悬液pH调节为2 ~ 9，并放置于震荡摇床中反应12 h，吸附设置3个平行。吸附反应结束后，将悬液离心，上清液过0.2 μm滤膜后，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定Cd、As浓度，初始浓度与平衡浓度的差值计算Cd、As吸附量。收集离心管底部胶状物，冷冻干燥后，进行X-射线光电子能谱表征。
1.3 表征分析将新鲜培养的细菌用25 ml/dm2戊二醛原位固定，并用乙醇多级脱水，在扫描电子显微镜(SEM，Quanta F250，Germany)上观察其形貌。
为获取细菌表面位点种类和浓度，进行自动电位滴定表征。滴定试验在Metrohmtitrator 836自动电位滴定仪上进行，滴定前通入氮气排除滴定杯中的CO2，随后先用0.1 mol/L HNO3滴定体系pH至3，稳定30 min后，再用0.1 mol/L NaOH滴定体系至pH 10左右。利用FITEQL4.0软件中的非静电模型(non-electrostatic model)拟合滴定数据，获得官能团种类和浓度。
X-射线光电子能谱(XPS)测定在Thermo ESCALAB 250XI电子光谱仪进行。采集C 1s和N 1s高分辨图谱，用XPSPEAK41软件拟合XPS光谱，C 1s(标准峰位约284.8 eV)用来校正峰位。
2 结果与讨论 2.1 细菌形貌和表面位点图 1为Delftia sp. 细菌的电镜图谱，该细菌为杆状，长度约为2 ~ 3 μm。细菌完整、表面光滑，且没有明显的疏松结合态胞外分泌物(LB-EPS)，因此重金属的吸附可能主要发生在细菌细胞壁表面。
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图 1 Delftia sp. 细菌的扫描电镜图谱 Fig. 1 SEM image of Delftia sp. |
为了获得细菌表面位点种类和浓度，开展了电位滴定试验。结果如图 2所示，横坐标为pH，纵坐标为质子消耗量(total H+，mol/L)，可间接代表细菌的总位点浓度。细菌在pH 3 ~ 10范围内的缓冲性较强，不同pH点斜率不同，代表细菌表面不同位点(官能团)的质子化。我们通过非静电模型拟合滴定数据可知，细菌表面主要有4种位点，分别是羧基、磷酰基、氨基和羟基，其对应的pKa分别为4.57、7.04、8.22和10.45(图 2)，相似的官能团种类也在其他细菌种类中发现[8, 23]。对比4个官能团浓度发现，羟基浓度最高为6.08 mmol/g，氨基最低为0.87 mmol/g，羧基(2.05 mmol/g)和磷酰基(2.52 mmol/g)浓度介于两者之间。必须指出的是：由于不同位点的解离常数(pKa)不同，因此pH会影响金属离子与官能团的结合顺序，例如在较低pH时，易解离的羧基可能发挥主导作用。此外我们发现，在pH 3时细菌表面电荷量约为-0.001 5 mmol/g，表明细菌的等电点应该在pH 3以下。
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图 2 Delftia sp.细菌的电位滴定图谱及模型拟合 Fig. 2 Potentiometric titration curve and model fit for Delftia sp. |
图 3为Cd(Ⅱ)与As(Ⅴ)在细菌表面的吸附量随pH的变化。从总吸附趋势看，Cd(Ⅱ) 的吸附量随pH升高而升高，而As(Ⅴ)的吸附量随pH升高而下降。这一趋势是由离子特性所决定的：在溶液中，Cd(Ⅱ) 以阳离子(Cd2+)形式存在，而As(Ⅴ) 以砷酸根阴离子(AsO43-)存在，随着pH升高，吸附体系负电性增加，两种元素吸附量随pH变化截然相反。
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(试验条件：细菌浓度0.1 g/L，金属浓度为0.2 mmol/L，背景电解质为0.01 mol/L NaCl) 图 3 Cd、As在Delftia sp.细菌上的吸附结果 Fig. 3 Adsorption of Cd(Ⅱ) and As(Ⅴ) to Delftia sp. |
对Cd而言，当pH < 5时，Cd-As复合体系中的吸附量大于单一体系；当pH > 5时，吸附量没有显著区别。其原因可能是：在较低pH时，As(Ⅴ) 在细菌表面吸附量很大(图 3)，而AsO43-的吸附使细菌体系的负电性增加，因此Cd2+与细菌的静电作用力增强，促进Cd(Ⅱ) 的吸附；随着pH升高，Cd(Ⅱ) 与细菌表面官能团的络合作用占主导，因此受静电力的影响不显著。与之相反，As(Ⅴ) 在复合体系中的吸附量小于单一体系，且在较高pH时更显著。其原因可能是由于电荷性质相反，AsO43-阴离子与细菌不存在静电吸附，可能主要通过络合作用结合，虽然Cd的吸附使体系负电性下降，但对络合作用几乎无影响；在高pH时，Cd与细菌表面位点的亲和力可能强于As，从而抑制As吸附。
因此，上述结果表明只有在强酸(pH < 5)环境中，As(Ⅴ) 促进微生物吸附Cd(Ⅱ)，在一般土壤环境中(pH > 5)，As对Cd的吸附几乎无影响；而Cd抑制As在微生物上的固定。
2.3 XPS分析利用X-射线光电子能谱(XPS)分析Cd与As在细菌表面的微观结合机制。图 4为Delftia sp. 吸附重金属前后的C 1s高分辨图谱，碳分为3个主要组分：能量位于约288.0 eV处为C=O/O=C=O，主要包括羧基、酯基；能量位于约286.2 eV处为C-(O, N)，为醇、氨和酰氨；能量位于约284.5 eV处为C-(C, H)，猜测为脂质或氨基酸的侧链[24-25]。Delftia sp. 吸附Cd、As前后不同组分的相对含量(峰面积)发生了明显变化，意味着这些组分参与了Cd、As的络合反应。
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图 4 Delftia sp.细菌吸附Cd(Ⅱ)及/或As(Ⅴ)前后的C 1s XPS高分辨光谱 Fig. 4 High-resolution C 1s XPS spectra of Delftia sp. before and after binding of Cd(Ⅱ) and/or As(Ⅴ) |
纯细菌在能量约为288.0、286.2和284.5 eV处组分所占比例分别约为11.2%、26.2% 和62.6%(图 4)；当细菌吸附Cd后，三者比例变为约16.4%、36.0% 和47.6%(图 4)，表明羧基和氨基参与了Cd的络合；当细菌吸附As后，羧基和氨基组分所占比例也有略微增加，但变化不大，可能主要因为As的吸附量远小于Cd，造成光谱变化不明显；当细菌吸附Cd和As后，三者比例变为约16.7%、38.2% 和45.1%，羧基和氨基组分的显著增加，意味着在Cd、As复合系统中，羧基和氨基参与了重金属的吸附。
进一步分析N 1s XPS图谱，结果如图 5所示。N主要分为两类组分，分别是非质子化氨基(Nnonpr)，位于约400 eV处，以及质子化氨基(Npr)，位于约401.3 eV处。纯细菌质子化氨基只占2.4%，这主要是因为氨基pKa较高，在pH 6.5时只有极少部分产生质子化。当细菌吸附Cd、As后，质子化氨基组分都有不同程度增加，这意味着少部分氨基参与了Cd、As的络合反应，进一步验证了上述C 1s结果。
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图 5 Delftia sp. 细菌吸附Cd(Ⅱ)及/或As(Ⅴ)前后的N 1s XPS高分辨光谱 Fig. 5 High-resolution N 1s and C 1s XPS spectra of Delftia sp. before and after binding of Cd(Ⅱ) and/or As(Ⅴ) |
虽然土壤中细菌种类繁多，且有革兰氏阳性和阴性，它们在细胞壁成分如磷壁酸、肽聚糖、脂多糖组成上有显著区别。但已有研究报道，革兰氏阳性菌和阴性菌在表面官能团组成上有非常高相似性，都富含羧基、氨基、磷酸基、羟基和巯基[3]，这些官能团是重金属吸附的主要位点。前人也有报道革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)和阴性菌(希瓦氏菌)对Cd的吸附位点相似，都为羧基、磷酸基和巯基[12]，因此本文Delftia sp. 细菌结果可在一定程度上反映一般土壤微生物吸附规律。此外，虽然Delftia sp.细菌与其他已报道的细菌相比，表面EPS较少，但Cd、As在微生物表面的吸附机理差异不会太大，因为EPS也是由多糖、蛋白质和核酸组成的大分子物质，主要官能团也为羧基、磷酸基和羟基等[26]。因此，EPS只会影响重金属在微生物表面的吸附量，Cd、As在官能团上的竞争/协同规律是不变的。
Cd、As复合污染在我国南方污染土壤中极为典型，两种元素化学特性截然不同，造成它们在土壤胶体界面的化学行为存在显著区别。微生物是土壤中典型的有机胶体体系，因此研究Cd、As在微生物体系的共存化学行为有极为重要的意义。本研究结果发现，在强酸性土壤中(pH < 5)，As促进Cd在细菌表面的固定，因此，单一Cd污染条件下的预测模型可能低估了Cd在复合污染土壤中的固定。在我国南方污染区，特别是部分极酸性的红壤土，必须考虑这一点。在一般土壤中，特别是表层土壤，pH多大于5，现有的基于单一污染条件模型适用于预测Cd在复合污染条件下的化学行为。与之相反，Cd的存在抑制As在微生物体系的固定，因此单一As污染条件下的预测模型可能高估了As在复合污染土壤中的固定。
本研究结果对土壤微生物修复也有一定的指导意义。根据吸附试验结果，我们估计细菌对重金属Cd的吸附量可达80 mg/g，要远强于土壤矿物对Cd的吸附能力(< 10 mg/g)[27-28]；在土壤根际微区，微生物占土壤固相的比例很大，因此在固定Cd并减少向植物体内迁移方面有重要作用。而在一般土壤中(pH约4 ~ 7)，由于竞争作用的存在，简单利用单一微生物修复Cd、As复合污染土壤并不是十分奏效，对Cd的效果可能较好，对As的修复效果可能极差。因此在治理Cd、As复合污染时，必须考虑研发基于微生物的复合材料，如微生物-Fe/Al/Mn氧化物复合材料，而目前关于微生物-矿物复合胶体对Cd、As的共吸附研究还很缺乏，这一点值得进一步关注。
3 结论在Delftia sp. 细菌表面，Cd(Ⅱ)的存在显著抑制As(Ⅴ)的吸附；pH < 5时，As(Ⅴ)促进Cd(Ⅱ)在细菌上的吸附，而pH > 5时，对Cd(Ⅱ) 吸附无影响。细菌表面富含羧基、磷酰基、氨基和羟基等不同pKa官能团，而其中羧基和少部分氨基参与了Cd、As的络合反应，且Cd和As在这些位点发生竞争作用。预测Cd、As在复合污染环境中的化学行为及治理修复时，必须考虑pH这一重要因素。
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