近年来,我国大力发展集约化种植,不仅施用了大量化肥,而且连续多年种植单一作物[1]。这种不合理的生产方式造成了土壤酸化、土壤有机质降低和土壤微生物群落严重失衡,致使作物出现严重的连作障碍,产量急剧下降,给农业经济带来了巨大损失[2-3]。以土传青枯病为例,该土传病害是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害[4],其传播范围广、易存活,可侵染番茄、辣椒、烟草等200多种作物[5],严重影响着我国茄科作物的产业发展。施用农药和熏蒸等传统方法虽然可在短时间内快速杀灭土传病原菌,但同时也会降低土壤微生物群落多样性,无法长期、有效地应对土传病害的再次爆发[6]。因此,绿色可持续的防控措施越来越受到人们重视,如施用生物有机肥的生物防控。生物有机肥是将有机肥料与功能微生物相结合制得的一种新型肥料,不仅能够培肥土壤,促进作物生长,其中的功能菌还能够抑制土传病原菌的生长[7-8]。
但有机肥会因堆肥原料的不同,导致不同原料堆制的有机肥养分含量差异显著。因此施用不同有机肥可能会影响土壤的肥力性状,如豆粕有机肥因含氮量较多,可有效提升土壤碱解氮和全氮含量,鸡粪有机肥对速效磷提升效果较好[9];秸秆有机肥可促进土壤有机碳的增加[10]。肥料的养分也有可能影响与其配伍的功能微生物发挥其在田间的功能,如有机肥发酵原料中含有较多氨基酸等含氮化合物,可促进功能菌解淀粉芽孢杆菌的增殖[11]。但尚未有研究表明不同原料的有机肥与功能菌配伍是否会影响作物的生长以及土传病害的防控。因此,本试验将以番茄土传青枯病为研究对象,研究以两种原料制备的生物有机肥对田间番茄的促生以及青枯病防控效果,探究土壤各理化因子与番茄促生及发病率的相关性,最终,结合不同生物有机肥对田间番茄土壤微生物群落的影响,确定更适于番茄生长且防控土传青枯病的生物有机肥类型。本研究有助于为选择适合功能菌株发酵的有机载体提供理论依据,并为选择合适的生物有机肥进行番茄土传青枯病防控提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试菌株和番茄品种供试菌株为解淀粉芽孢杆菌T-5(Bacillus amyloliquefaciens),该功能菌株有较强的防控土传青枯病和促进番茄生长的效果[12];供试番茄品种为GBS-极品903。
1.1.2 供试基质生物有机肥的制备使用秸秆有机肥和鸡粪有机肥与功能菌解淀粉芽孢杆菌T-5分别进行基质生物有机肥的制备。秸秆有机肥由南京明珠肥料有限责任公司生产,鸡粪有机肥由南通尔康生物有机肥有限公司生产。
秸秆基质生物有机肥与鸡粪基质生物有机肥由解淀粉芽孢杆菌T-5分别与秸秆有机肥和鸡粪有机肥经二次发酵制成,具体过程如下:将解淀粉芽孢杆菌T-5菌悬液(1×109 cfu/ml)按50 ml/kg接种至秸秆或鸡粪有机肥中,堆置混合发酵5 d,发酵过程中每天定时翻堆1次,保持通气并维持湿度在60% ~ 65% 范围内。二次发酵完成后,肥料中解淀粉芽孢杆菌含量达到1×108 cfu/g以上,分别获得秸秆基质生物有机肥(BIO1)和鸡粪基质生物有机肥(BIO2)。两种生物有机肥理化性质如表 1所示。
田间试验地点为南京市江宁区麒麟镇后村(118°57′E,32°03′N),该地连作番茄多年,番茄土传青枯病频发。土壤为黄棕壤,土壤基本理化性质如下:有机质含量32.88 g/kg,全氮含量1.27 g/kg,有效磷含量为145.63 mg/kg,速效钾含量为220.15 mg/kg,土壤pH为6.23。
1.2 试验设计试验设置4个处理,具体如下:农户习惯施肥(CF)、秸秆基质生物有机肥(BIO1)、鸡粪基质生物有机肥(BIO2)、不施肥(CK)。农户习惯施肥用量和时间为:复合肥(13–7–21)在2月上旬作为基肥施入,施肥量为1 000 kg/hm2;在3月下旬使用复合肥(10–6–32)进行追肥一次,施肥量为500 kg/hm2。生物有机肥处理将生物有机肥作为基肥施入(200 g/株)。基肥均在番茄移栽前以撒施形式施入土壤,覆土拌匀后将番茄移栽至土壤中。试验地其他田间管理均保持一致。每个处理3个重复(3个小区),共计12个小区,采用随机区组排列。每个小区面积12 m2,每小区种植48株苗。
1.3 测定项目及方法 1.3.1 田间番茄生物量的测定及土样采集于番茄收获期采集番茄植株样品,测定番茄株高、茎粗、地上部鲜干物质量,番茄株高和茎粗分别用卷尺和游标卡尺测定。各小区随机选择4株健康番茄测定植株地上部生物量并获取根际土。轻摇番茄根掉落下的土壤为土体土,一部分放入4℃冰箱待测土壤铵态氮和硝态氮,另一部分风干用于测定土壤理化性质。植物根系放入锥形瓶中,经超声波震荡,分离下来的土壤为根际土壤,存于–80℃冰箱待用。
1.3.2 番茄产量和品质的测定从番茄始果期开始每4 d采集各小区番茄果实,第5次采摘全部剩余番茄果实,计算5次各小区番茄质量总和,即为各小区番茄总产量。
每个小区取3个成熟番茄,环切番茄取得番茄果实样品,测定果实中可溶性固形物、可滴定酸和维生素C的含量。可溶性固形物采用手持折光仪测定[13];可滴定酸采用酸碱滴定法测定[14];维生素C采用2, 6-二氯靛酚法测定[15]。糖酸比为可溶性固形物与可滴定酸含量的比值。
1.3.3 青枯病发病情况的统计移栽72 d后番茄开始发病,每5 d记录1次发病情况直至病情稳定。选取最后一次记录表征番茄发病率。发病率计算公式:发病率(%)=小区发病植株数/小区总植株数×100。根据青枯病发病开始到病情稳定时期的发病趋势计算病程线下面积[16],表征番茄青枯病的严重程度。
1.3.4 土壤样品理化性状测定测定指标包括土壤pH、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾、有机质。其中土壤pH采用酸度计法(V水∶m土=5∶1)测定;土壤铵态氮、硝态氮采用流动分析仪测定[14];其他土壤化学性质测定参考《土壤农化分析》[17]。
1.3.5 根际土DNA提取及高通量测序称取0.3 g番茄根际土,采用PowerSoil土壤DNA提取试剂盒(MoBio, Carlsbad, CA, USA)提取土壤DNA。详细的操作步骤按DNA提取试剂盒说明书进行,提取后的DNA用Nanodrop(ND2000, Thermo Scientific, DE, USA)检测浓度,并于–20 ℃保存备用。土壤微生物群落高通量测序使用细菌16S rRNA(V4区)通用引物(515F 5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’和806R 5’- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)进行测序。
1.3.6 数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel 2016、IBM SPSS Statistics 25和R(3.6.3)进行处理与分析,采用ANOVA单因素方差分析法进行方差分析,邓肯(Duncan)多重检验法检验处理间的差异显著性(P≤0.05),利用Spearman相关系数来研究变量间的相关性。土壤微生物高通量测序数据利用R(3.6.3)中vegan包进行多样性和冗余分析。
2 结果与分析 2.1 不同生物有机肥对土传青枯病发病率的影响如图 1A所示,与不施肥对照(CK)和常规施肥(CF)处理相比,施用秸秆生物有机肥(BIO1)和鸡粪生物有机肥(BIO2)均可显著降低番茄青枯病的发病率。但两种生物有机肥处理对降低番茄青枯病发病率的能力不同,BIO1处理下青枯病发病率最低(2.08%),与CF处理相比可降低94.45% 的发病率;BIO2处理下番茄青枯病的发病率为20.14%。
不同施肥处理的病程线下面积与发病率表现出同样的趋势(图 1B)。BIO1和BIO2处理均可显著减轻番茄青枯病的发病程度,其中BIO1处理的番茄发病程度最低,比CK处理的发病率减少了96.13%,比CF处理减少了95.30%。
2.2 不同生物有机肥对番茄植株生长的影响如图 2所示,与CF处理相比,两种生物有机肥均能显著促进番茄地上部的生长,但效果略有差异。具体而言,BIO1和BIO2处理对番茄株高、地上部干鲜物质量的促进作用并无显著差异(P > 0.05,图 2A、2C和2D),而对茎粗的促进作用具有显著差异,BIO2处理的番茄茎粗比BIO1处理提高了3.9%(图 2B);与CF处理相比,BIO1处理可增加14.55% 茎粗,BIO2处理可增加19.09% 茎粗。
如图 3所示,两种生物有机肥对番茄产量和果实品质均有不同的影响。与CF处理相比,施用两种生物有机肥均可显著提高番茄的产量。BIO1处理的番茄产量最高,达4 306.29 kg/667m2,与CF处理相比增产55.80%;但BIO1与BIO2处理间番茄产量并无显著差异(图 3A)。
与CF处理相比,施用两种生物有机肥对番茄果实中维生素C、可溶性固形物、可滴定酸含量及糖酸比均无显著影响(图 3B~3E)。与CK处理相比,BIO1处理可显著提高番茄果实维生素C含量和糖酸比(图 3B和3E),可显著降低可滴定酸度(图 3D),显著提高糖酸比(图 3E)。
2.4 不同生物有机肥对土壤理化性质的影响不同基质生物有机肥处理后土体土的理化性质检测结果如表 2所示。总体而言,两种基质生物有机肥处理均可提高土壤有机质含量。与CF处理相比,BIO1处理可显著提升土壤有机质含量,但BIO2处理则无显著影响,两种生物有机肥处理间也无显著差异。与CF处理相比,施用生物有机肥后,土壤pH均呈上升的趋势,其中,BIO2处理的土壤pH显著升高,但BIO1处理无显著影响(图 4A)。此外,与CF处理相比,两种生物有机肥处理后对土壤硝态氮、铵态氮、有效磷和速效钾的含量无显著影响。
通过分析土壤各化学因子与番茄发病率、生长、产量与果实品质的相关性,探究对番茄发病和促生具有显著影响的土壤化学因子,结果(表 3)表明,土壤有机质含量与番茄的发病率、株高、茎粗、地上部鲜物质量和产量呈显著正相关关系,说明土壤有机质含量的增加有利于减轻番茄土传病害的发生,并促进番茄生长和产量增加。此外,土壤硝态氮和速效钾含量与番茄地上部干物质量具有显著正相关关系,说明土壤硝态氮和速效钾含量的提高有助于增加番茄整体生物量;土壤中铵态氮含量则与番茄产量具有显著负相关关系。土壤各理化因子与番茄果实品质均无相关性。
对各处理番茄根际土的细菌群落进行扩增子测序,分析不同施肥处理对番茄根际细菌群落的影响,结果如图 4所示。施用化肥(常规施肥,CF)会降低根际细菌群落的α-多样性,即Chao1指数,而施用生物有机肥(BIO1和BIO2)可显著提高根际细菌群落的α-多样性,但与CK处理无显著差异(图 4A)。β多样性分析结果表明,施用肥料后,根际细菌群落结构显著改变,其中施用生物有机肥(BIO1和BIO2)均可显著改变根际细菌群落的β-多样性(Stress = 0.06,图 4B)。
进一步考察不同生物有机肥处理对根际不同种类细菌相对丰度的影响发现,不同施肥处理下细菌OTU主要属于10个门,细菌在门水平上的相对丰度存在差异。与CF处理相比,BIO1和BIO2处理可提高变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度,但降低了放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度(图 4C)。值得一提的是,与BIO2处理相比,BIO1处理的变形菌门相对丰度最高,放线菌门相对丰度最低,但芽孢杆菌属(Bacillus spp.)的相对丰度无显著差异(P > 0.05)。
2.7 土壤理化性质对根际细菌群落的影响为了考察土壤理化因子对根际细菌群落的影响,进行了土壤化学参数和各施肥处理下根际细菌群落构成的相关性分析,结果如图 4D所示。冗余分析结果表明,土壤硝态氮和pH是显著影响根际细菌群落的两个主导因子(硝态氮:F = 3.02,P = 0.003;pH:F = 2.18,P = 0.034),其中土壤硝态氮的影响最显著。土壤硝态氮和pH与变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)呈正相关关系,与放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)呈负相关关系。
3 讨论大量研究表明,施用生物有机肥可降低作物土传病害的发病率、促进作物生长,并提高果实品质[18-19]。本研究也发现,施用生物有机肥可显著降低番茄土传病害的发病率,并且提高番茄果实的产量和果实品质。这是由于施用生物有机肥可改善土壤理化性质,如提高土壤pH、增加土壤中的有机质。土壤理化性质与番茄发病、生长的相关性分析表明,番茄的株高、茎粗、地上部鲜物质量和产量都与土壤有机质含量呈正相关关系,发病率与有机质含量呈显著负相关。本文推测一方面生物有机肥的施用增加了土壤微生物多样性和活性,加快了矿质养分的释放,持续提供给作物生长需要[20];另一方面生物有机肥中的功能菌解淀粉芽孢杆菌可分泌抗生素、生长素、铁载体等功能物质,降低番茄发病率并促进番茄生长[21]。此外,虽然试验结果表明速效钾、铵态氮和硝态氮含量与番茄生长或产量有相关性,但这些养分能否影响番茄的生长情况均有待进一步的养分调控试验验证。有研究表明,长期施用生物有机肥可提高土壤中的速效养分[22],本研究只在番茄温室施用了一次有机肥(作为基肥施入),有效磷和速效钾含量虽有提高,但并不显著,推测如果继续或长期施用生物有机肥,不同处理间土壤的速效养分(氮、磷、钾)差异会逐渐显现,生物有机肥对作物生长的效果也会更明显。
此外,本研究还发现两种生物有机肥表现出显著不同的番茄青枯病防控效果,秸秆生物有机肥(BIO1)对番茄青枯病的防控效果显著优于鸡粪生物有机肥(BIO2)。这可能是由于两种有机肥的制备原料影响了功能菌株的生长或生防功能的发挥。进一步分析两个生物有机肥处理的芽孢杆菌属微生物相对丰度,发现二者并无显著差异,推测可能是不同原料的有机肥对功能菌拮抗和促生物质分泌的影响不同。有机肥作为功能菌发酵过程中的营养载体,为功能菌的增殖提供可利用的养分,为功能菌发挥生防特性奠定基础[23];养分种类以及有机载体成分可影响功能菌拮抗物质的产量[24-25]。而本研究中不同原料有机肥对功能菌T-5拮抗物质产量的影响有待进一步研究,以为功能菌二次发酵条件的优化提供理论基础。
施用生物有机肥还可通过调控根际细菌群落影响土传病害的发生[26–29]。本研究中通过分析根际细菌群落结构发现,施用生物有机肥可增加细菌群落多样性,改变细菌群落结构;可增加变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度,降低放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的丰度。Xiong等[30]研究发现,生物有机肥通过重塑土壤微生物群落来诱导土壤对枯萎病的抑制作用,生物有机肥可显著提高细菌变形菌门的丰度,降低放线菌门的丰度。本研究的结果与之一致,说明生物有机肥对土壤细菌群落的调控作用主要是影响了变形菌门和放线菌门的相对丰度,进而提高了土壤整体的抑病能力,减少了土传病害的发生。虽然两个生物有机肥处理中芽孢杆菌属微生物相对丰度并无显著差异,但BIO1处理中变形菌门相对丰度升高,本文推测芽孢杆菌属的微生物激发了变形菌门微生物的丰度,进而增强了根际的抑病能力[29]。本研究还发现土壤细菌群落受土壤硝态氮和pH影响最大,与Jiang等[31]试验发现硝态氮是影响土壤微生物群落较大的驱动因素之一较为一致。但硝态氮对微生物群落,尤其是变形菌门和拟杆菌门的影响需通过养分投入试验进一步验证。
4 结论施用生物有机肥可显著降低番茄土传青枯病的发病率,但不同原料制备的生物有机肥对番茄抵抗土传青枯病和促生的效果不同。其中以秸秆为原料发酵制备的生物有机肥的抑病效果最佳,对番茄果实产量及糖酸比有提升作用;与常规施肥相比,其显著提升了土壤的有机质含量,增加了根际微生物多样性,其中变形菌门和拟杆菌门相对丰度增加。
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