2022, Vol. 54
多环芳烃(PAHs)是具有多个稠合苯环结构的一类化合物[1]，是由煤、柴油、木材和植被等有机物不完全燃烧产生，自然过程中如火山爆发和森林火灾也会产生[2]。目前已发现有100多种不同结构的PAHs化合物，其中大部分分子的水溶性低，并可被固体颗粒吸附，它们能在生态系统中存在多年而不被去除。且随着苯环数的增加，它们在水中的溶解度降低，吸附力增大[3]。研究发现这类化合物具有致畸致癌致突变的危害，因此被联合国列为重要的有机污染物，引起了人们的极大关注[4-7]。
针对土壤中的PAHs污染，人们已经发展了物理、化学、生物等修复方法，以及化学和植物联合修复和微生物–植物联合修复等技术[7-11]。对PAHs污染的土壤进行原位微生物修复，比物理和化学修复具有高效性、经济性和环境友好性。在微生物原位修复中，可以通过筛选有效降解菌、添加营养剂和表面活性剂等方法来增强修复的效果[12-13]。在前期的研究中，已有许多把锯末等农林废弃物制成生物质炭来促进微生物原位修复污染土壤的报道[14-15]，但是直接把锯末应用于强化微生物降解去除土壤中有机污染的报道还不多。在土壤中添加锯末可提高土壤孔隙度和持水能力，而且锯末中的纤维素和木质素也被微生物利用因而促进微生物的生长[16-17]。这些微生物通常会产生漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和多用途过氧化物酶等有效地氧化木质素[18]。因此，农业和林业废物可以提高特定环境中微生物的活性，以提高碳氢化合物生物降解的效率。但是这些研究都是在单一菌群或是水溶液中进行，而土壤作为一个复杂的生态系统，其物理化学和生物学特性完全不同于上述系统。本研究选择5种不同类型土壤、3种不同树种锯末和不同粒径锯末，探究PAHs污染土壤中加入锯末能否提高荧蒽特效菌(Mycobacterium flavescens，MC)降解PAHs有机污染物的能力。本研究结果可用于指导强化微生物原位修复PAHs污染土壤。
1 材料与方法 1.1 材料供试特效降解菌MC来自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，编号为ATCC 700033[19]，是从印第安纳州西北部的大卡鲁梅特河底泥中分离出的一种黄色分枝杆菌，以芘为唯一碳源和能源，并能够显著降解荧蒽。
供试3种锯末(saw dust，SD)均为干样，分别来自松树、香樟树和橡树树种。松树木材常用于建筑、电杆、枕木、矿柱、桥梁、农具、器具、家具等制作；香樟树树木多用于造船、橱箱和建筑等；橡树本身十分耐磨，是各国发动机缸垫的原材料，也被广泛用于生产葡萄酒和香槟酒的酒塞。由于3种木材的广泛应用，必然产生大量的锯末，使之廉价易得。3种锯末的基本理化性质为：松树锯末：有机质716.92 g/kg，全氮3.24 g/kg；香樟锯末：有机质518.66 g/kg，全氮2.16 g/kg；橡树锯末：有机质542.70 g/kg，全氮2.31 g/kg。本研究中，由于松树锯末的联合修复效果较好，且松树锯末比较常见，试验以松树锯末进行多影响因素研究，包括锯末添加量(占总土质量的0.1%、0.5%、1.0% 和2.0%)和锯末粒径(10目、20目和60目)。锯末粒径通过以下方法进行筛选，操作如下：首先用粉碎机进行粉碎，在利用10、20和60目孔径的筛子进行筛选。
供试5种土壤类型，分别为安徽黄棕壤、黑龙江海伦黑土、江西鹰潭红壤、山东聊城潮土和浙江嘉兴水稻土，其基本理化性质见表 1。在这5种土壤中均未检测出荧蒽和芘污染。本试验人为添加10 mg/kg的荧蒽和10 mg/kg的芘于5种土壤中，并将土壤放置于避光通风处进行自然老化两周。老化后的土壤中荧蒽和芘的实测值为初始含量。(在锯末添加比例的试验中，污染物荧蒽和芘的浓度设置偏高。)
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表 1 土壤基本理化性质 Table 1 Physicochemical properties of tested soil |
制备降解菌MC的菌悬液：将实验室保存的MC菌接种至50 ml LB培养基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、加水至1 L，pH 7.2)，置于恒温振荡培养器(28℃、150 r/min)中培养1 d；然后在4℃、10 000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，并向离心管加入30 ml无菌生理盐水(0.9% 氯化钠溶液)，摇匀，在相同条件下离心10 min，弃去上清液。如此反复3次，用无菌生理盐水调节降解菌的菌悬液OD值为1.0(在600 nm处测定值)。
液体摇瓶预试验：设置两个处理组，分别为①CK：于250 ml三角瓶中加入100 ml无机盐培养基，并加入污染物荧蒽和芘，使最终浓度为6 mg/L；②MC：于250 ml三角瓶中加入100 ml无机盐培养基，并加入污染物荧蒽和芘，使最终浓度为6 mg/L，再加入1 ml MC菌悬液于无机盐培养基中。实验操作在无菌工作台中完成，用封口膜封住瓶口，于黑暗条件下在恒温振荡培养器(28℃、150 r/min)中培养，分别于0、4和8 d取样测定。
土壤微宇宙培养试验：在20 ml的棕色玻璃瓶中装入10 g污染土，在需要加入锯末的处理中，将一定添加比例和粒径的锯末与1 ml上述特效菌悬液混合拌匀后再与污染土壤混合；空白实验中不加MC菌和锯末。在各种处理中将含水率调至20%，用封口膜封住瓶口，于25℃黑暗条件下培养。这些培养瓶放入培养箱，每天加水调节土壤含水量，分别于0、15和30 d进行取样测定。
红壤酸碱度调节试验：向一定量红壤样品中添加少量1 mol/L NaOH，并用去离子水将所有土壤样品水分含量均调至为最大持水量的65%。将处理后的土壤置于25℃下恒温培养。每天取少量土壤检测其pH，如果pH没有调至所需值，通过添加1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH进行调节，直至土壤pH趋于所需稳定值。
1.3 土壤PAHs测定方法样品中芘和荧蒽的提取：将土壤悬液混匀、冷冻干燥并磨细，然后称取1 g土样加入5 ml正己烷+丙酮(1∶1，V/V)混合液，涡旋混匀后，振荡1 h，静置一段时间后，取提取液上层并过0.22 μm有机滤膜后加入样品瓶，上机测试。
样品中芘和荧蒽浓度的检测：GC7890B-5977A气相色谱质谱联用仪(日本岛津公司)；色谱柱：SH-Rxi-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细柱；正己烷、丙酮均为HPLC级。色谱条件：进样口温度250℃，柱流速1 ml/min；进样量1 μl；分流比5∶1；程序升温，60℃保持1 min，以10℃/min升至280℃，保持5 min。质谱条件：全扫描(Scan)；扫描离子范围，45 ~ 400 m/z，EI源；离子化能量70 eV；离子源温度200℃；四级杆温度150℃；接口温度250℃；溶剂延迟5 min。
1.4 数据处理采用Microsoft Excel 2013、SPSS 20.0和Origin 2019软件进行数据处理和绘图，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)法确定各处理之间的差异显著性，然后用Ducan法进行多重比较检验(P < 0.05)。
2 结果与讨论 2.1 降解菌降解特性MC菌是荧蒽和芘去除的特效降解菌，近年不少学者利用MC菌研究细菌降低植物体内PAHs的机理，并探究其应用于减少蔬菜中PAHs累积的方法[20-21]。在预试验中，通过液体摇瓶培养试验培养MC菌(28℃暗黑条件下培养8 d；转速为160 r/min；接菌量：取富集后OD600为1.0左右的对数期MC菌1ml于100 ml无机盐培养基中)，发现MC菌在8 d内对荧蒽的降解去除(8 d内100% 去除)比对芘的去除(8 d内14.21%)更快(图 1)。
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图 1 荧蒽和芘在MC菌培养液中降解 Fig. 1 Degradation of fluoranthene and pyrene in MC culture medium |
从5种老化后土壤的微宇宙培养试验结果来看(图 2A)，除黑土和潮土外，老化土壤中的荧蒽在20% 湿度条件下30 d内不容易被完全降解，且在不同土壤中荧蒽的去除速率不同。其中，黑土中荧蒽降解去除最快，15 d后去除89.92% ± 0.37%；潮土中荧蒽在15 d时降解去除(22.48% ± 3.96%)效果不佳，而15 d后降解加速，到30 d时去除率为95.16% ± 0.82%；而黄棕壤和红壤中荧蒽的去除率在30 d时仅为34.45% ± 7.71%，说明这两种土壤中缺乏有效的荧蒽降解菌。在荧蒽和芘共同老化的黄棕壤中添加MC菌，培养15 d后，发现MC菌能显著促进老化黄棕壤中荧蒽的降解(57.40% ± 4.71%)，但不能显著促进芘的降解(图 2B)。因此，后续试验以荧蒽污染土壤为主要研究对象。
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(图B中供试土壤为黄棕壤，培养15 d)，MC代表Mycobacterium flavescens降解菌，SD代表木屑，百分比代表添加比例；柱图上方不同小写字母表示荧蒽(芘)在不同处理之间差异达P < 0.05显著水平；下同) 图 2 荧蒽在老化土壤中的变化(A)及锯末添加比例对荧蒽和芘降解效果的影响(B) Fig. 2 The changes of fluoranthene concentrations in soils(A)and the effects of sawdust addition ratio on the degradation of fluoranthene and pyrene(B) |
当培养土(黄棕壤)中添加MC菌和锯末(松树，尺寸20目)时，荧蒽的提取浓度进一步降低，而且当锯末添加量为0.1% 和0.5% 时对荧蒽降解效果比1.0% 和2.0% 的添加量更显著；其中当添加量为0.5% 时，不仅荧蒽提取浓度显著降低，而且芘的提取浓度也有显著性降低，而其他锯末添加量并不能显著降低芘的提取浓度。这一结果说明，在适当条件下锯末的添加可以强化MC菌有效降解去除土壤中的荧蒽和芘。通过检测培养25 d后的黄棕壤中的微生物菌落数，发现添加锯末的土壤中微生物菌落数显著提高(8.76 CFU/g ± 0.36 CFU/g)，约是空白对照组(5.37 CFU/g ± 0.42 CFU/g)和只添加MC菌的土壤中微生物菌落数(5.83 CFU/g ± 0.29 CFU/g)的1.5倍。因此，在黄棕壤中锯末的加入可以显著提高土壤微生物群落的菌落数，促进土壤中荧蒽的去除，可能原因是锯末可为降解菌提供一个适宜生长繁殖的环境，也可能增加了微生物的食物和营养。这与前期的研究结果相符，如锯末的加入可以促进土壤中石油降解菌(鞘氨单胞菌、Idiomarina和Phenylobacterium以及Humicola、Wallemia和Graphium真菌)的生长，从而促进石油污染土壤中PAHs的降解[21]。
图 3A显示了不同粒径锯末对荧蒽污染黄棕壤修复25 d后的去除效果，结果表明，锯末粒径为20目时对MC去除荧蒽的效果最好，增加了42.63% ± 1.05% 的去除率；其中当锯末粒径为10目时，与空白处理组相比没有差异，与添加MC处理相比，反而有所抑制MC降解菌的降解效果。这说明锯末粒径过小对MC原位去除荧蒽没有作用，而尺寸太大会降低锯末的强化作用。
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图 3 锯末粒径及种类对荧蒽降解效果的影响 Fig. 3 Effects of sawdust size and types on degradation effect of fluoranthene in soil |
图 3B显示了松树、橡树和香樟树锯末(尺寸20目)对荧蒽污染的黄棕壤修复10 d后的降解效果，其中香樟树锯末对降解菌MC去除荧蒽强化效果最好，降解率提高了35.05% ± 1.64%；松树锯末对MC降解菌促进荧蒽降解效果提高了12.55% ± 2.42%；而橡树锯末对降解菌MC去除荧蒽没有显著影响。不同锯末的促进效果不同，可能是因为不同锯末所含纤维素、木质素的含量不同，也有可能是其物质性质(如体内纤维素孔径不同)，或者含有一些特殊的物质影响微生物生长，这有待进一步的深究。而且不同品种锯末本身可能带有一些能够降解PAHs的微生物群落，而这些不同群落对PAHs的降解能力不同也可能是导致几种锯末促进降解PAHs效果不同的原因，如Ali等[16]在锯末中分离出的真菌(如Candida sp. SDF1、Penicillium sp. SDF4、Cladosporium sp. SDF7)和细菌(如Actinobacterium sp. SDB1、Micrococcus luteus SDB2、Rhodococcus opacus SDB4)都能去除相当比例的菲和正十六烷。
2.4 土壤类型对锯末原位强化修复效果的影响荧蒽污染的土壤(黄棕壤、黑土、潮土、水稻土和红壤)在空白对照处理中显示不同的原位去除荧蒽的效果(图 2A)。图 2B和图 3的试验结果显示，锯末的添加可以强化MC菌降解去除黄棕壤中的荧蒽污染。对于其他4种土壤，试验结果(图 4)显示，黑土中，空白对照处理、只添加MC处理与添加MC+锯末处理土壤中荧蒽去除的趋势大体一致，15 d时去除率为82.28% ± 1.14%，30 d时去除率为89.28% ± 0.77%，其中，15 d时与空白对照处理相比，MC处理和MC+锯末处理均能显著降低荧蒽浓度，但两处理间并无差异；30 d时与空白对照处理相比，MC和MC+锯末处理组均能显著降低荧蒽浓度，且MC+锯末处理较单一降解菌MC处理有显著(12.5%)促进作用，说明在黑土中加入锯末强化去除荧蒽有显著作用。在空白对照处理中未加入MC菌和锯末，15 d后也可以很快去除荧蒽，可能的原因是黑土中存在可以降解污染物荧蒽的微生物群落，并且黑土中有机质含量(54.71 g/kg)很高，微生物群落生长较快，因此对污染物荧蒽的去除也快。HUANG等[22]的研究发现，黑土在培养21 d后可将5、30和70 mg/kg的芘降解完全，且芘的减少与土壤中芘双加氧酶基因(nidA)丰度的增加呈正相关关系。
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图 4 锯末对荧蒽污染的土壤的修复效果 Fig. 4 Remediation effects of sawdust on fluoranthene contaminated soils |
潮土中，只添加MC处理和添加MC+SD处理土壤中荧蒽降解趋势大体一致，15 d时降解率为55.25% ± 1.13%，30 d时降解率为96.36% ± 0.21%，并且两处理在15 d和30 d时并没有显著性差异，说明锯末在潮土中对MC降解荧蒽没有促进作用。无添加对照处理土壤中荧蒽在前期降解缓慢，后期快速降解。其可能原因是潮土中也含有能够降解荧蒽的微生物群落，但由于潮土有机质含量(8 g/kg)偏低，微生物群落复苏、繁殖缓慢，15 d后微生物完全复苏并大量繁殖快速降解污染物荧蒽。本试验结果与Ren等[23]研究结果相符，在人为添加芘的黑土和潮土中，芘在潮土中42 d后才能完全被去除，而在黑土中只需21 d。
水稻土中，加入MC能够有效去除荧蒽，但锯末没有显著的强化效果。无添加对照处理中荧蒽去除速率显著慢于其他两个处理土壤，添加MC处理和添加MC+锯末处理的土壤中荧蒽的去除在15 d和30 d时并没有显著性差异，分别为55.62% ± 0.83% 和75.42% ± 1.07%。这一结果说明，水稻土中存在能够降解荧蒽的微生物群落但荧蒽降解菌较少，而锯末在水稻土中里强化效果不明显。有研究表明，采自江苏常熟的未污染水稻土在人工添加芘后，培养42 d土壤中芘降解了98%[24]。
相比于其他4种土壤，红壤中荧蒽的降解最慢，添加MC处理土壤中荧蒽含量与无添加对照处理土壤样品中无明显差异，而添加MC+锯末处理虽然有显著强化作用，但仅仅提高了5.23%的降解率，而且在培养30 d后三组处理间的差异性消失。由此可知，特效降解菌MC在污染红壤中不能有效促进荧蒽的降解，推测可能的原因是红壤偏酸且有机质含量低，抑制降解菌的繁殖，加入锯末只在前期起到一定的促进作用。有学者也曾研究江西鹰潭红壤中微生物对芘的利用情况，研究发现，红壤中原有的微生物群落不能有效去除芘[23]，但把水稻土与红壤混合后，在水稻土中具有能够利用PAHs的微生物，并且水稻土与红壤的混合改变了土壤的理化性质，因此随水稻土的添加比例增加使有效的降解菌进入土壤而促进混合土壤中芘的去除[24]。如果把红壤pH从4.91(表 1)调整为5.80，进行3种处理，结果发现，在16 d后添加MC处理土壤和添加MC+锯末处理土壤中荧蒽的含量显著低于与无添加对照处理(图 5)，但添加锯末没有显著强化效果，此结果说明pH会显著影响降解菌修复红壤中的荧蒽污染。这一结果与付登强等[25]的研究结果一致，其研究发现，如果改变土壤的pH从4.7提升至6.1后，土壤中的菌落数增长了约24倍。
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图 5 红壤调整pH前后修复效果 Fig. 5 Remediation effects of red earths before and after pH adjustment |
本研究发现，锯末的添加可以加速有效降解菌对荧蒽的去除，但对芘的降解去除没有显著强化作用；而且最佳的锯末粒径为20目，添加量为土壤总质量的0.1% 和0.5% 时促进效果最好。不同树种制得的锯末效果不一，如松树和香樟树的修复强化效果比橡树的好。对于不同土壤类型，添加降解菌MC和锯末的修复效果差异较大，其中锯末的添加在黄棕壤中的强化修复效果最好；添加锯末对于黑土中荧蒽的原位降解有显著促进作用，而对于潮土，锯末和MC处理能在前期加速降解荧蒽；对于水稻土和红壤，锯末的强化修复作用不明显；而增加土壤酸碱性(4.7 ~ 6.1)可以增加锯末的强化修复效果。本研究结果表明锯末强化微生物修复PAHs污染土壤有许多影响因素，应有针对性地应用，对于有机质含量高微生物群落多的土壤不需要有效微生物的添加。
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