2022, Vol. 54
2. 湖南省烟草公司永州市公司, 湖南永州 425000
烟草作为一种重要的经济作物，在我国黄淮、西南、东南等地区有着广泛的种植[1]。然而，由于不合理的种植制度、施肥和水分管理等因素，对植烟区烟株生长有益的促生菌难以在植物根部定殖和增殖，导致烟叶产量降低、品质持续下降[2-3]。对此，一般采取轮作、添加土壤改良剂和实行不同的施肥方式等措施，但效果有限，且针对性不强[3-5]。
根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指生活在根际或根表区域内对植物的生长起促进作用的微生物[6-7]。已有研究证明，根际“有益菌群”在促进植物生长、提升抗逆性、抗病等方面发挥重要作用[8-10]。例如，何斐等[11]从健康的魔芋根际中发现2种优势细菌B18和B17，对魔芋生长具有促生和抗病能力。张从宇和孔德树[12]从大豆根际分离出20株对植物病原真菌具有拮抗作用的细菌，表现出对多种病害的良好防效。然而，已有研究大多采用“抖根法”获取植物根际土壤样品，无法避免非根际土壤或植物根表土对根际土壤样品的“污染”或影响。例如，本课题组前期研究发现，花生根际微生物数量显著低于根表，这说明根表微生物与根系生理生化代谢活性密切相关，是植物健康状况关键指示器[13]。因此，根据其自身生态位特性，分离筛选植物根表定殖力强的功能微生物，是未来获取高效微生物资源、优化根区生态功能和改善植物生长健康的重要基础。对此，从样品采集及分析方法上对“根表”与“根际”土进行区别研究，有助于利用关键微生物种群对植物生长健康开展精确调控。
本研究采集了湖南永州烟草种植区代表性田块土壤样品，通过温室盆栽试验结合16S rRNA基因序列鉴定和对比分析，分析烟草根表可培养微生物群落特征。由于分离获得的微生物群落组成之间存在较大差异，为寻找更多具有促生能力的菌株，从3种及以上代表性土壤中共同存在的属中，选择代表性菌株开展促生能力分析[14]。研究旨在获得植烟根表稳定定殖的微生物菌群，鉴别对烟草生长具有促进能力的菌株，为改善烟草根区微生物生态功能提供参考和理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试土壤与烟草供试土壤选自湖南省永州市烤烟产区蓝山、江华、冷水滩等4种代表性的烟田，在每种田块中选取多点采集耕层土壤100 kg，共采集4种不同质地代表性土壤样品用于后续盆栽试验，各土壤样品的具体理化性质见表 1。供试烟草(Nicotiana tabacum L.)为永州当地烟区普遍栽植的云烟87。
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表 1 四种供试土壤理化性质 Table 1 Physical and chemical properties of four tested soils |
在温室进行盆栽试验，每个土壤处理设置10盆重复，每盆栽种1株烟苗，盆钵随机摆放，期间定时定量浇水。移栽40 d后，选取长势一致的烟株进行破坏性取样，拔出整棵植株以获得完整根系，抖落根部明土。按照Edwards等[15]方法将根系放入装有磷酸盐缓冲液(PBS)的无菌烧瓶中，用无菌镊子摇动根系，以清除根系残留的根际土壤。用PBS缓冲液冲洗根部3次后将根系放入装有PBS缓冲液的锥形瓶中振荡，40 KHz超声1 min，使根表微生物全部进入缓冲液中，得到烟草根表微生物悬液，离心后去掉上清液即获得烟草根表微生物组。
1.3 根表微生物分离及鉴定根表微生物分离所用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)和TSA液体培养基。吸取0.2 ml根表微生物悬液，梯度稀释后，在1/10 TSA培养基上涂布，每个土壤处理3个重复。在20 ℃下培养7 d后，选择形态各异的菌株，用无菌接种环挑取单个菌落到TSA培养基上进行纯化培养。纯化多次后。即可得到单个菌株，根据平板细菌形态观察，舍弃重复菌株。
用细菌基因组DNA提取试剂盒(购于天根生物试剂公司)提取细菌总DNA，采用16S rRNA基因的通用引物：上游引物16S F：5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’；下游引物16S R：5’-GGCTACCTT GTTACGACTT-3’对菌株进行16S rRNA基因序列扩增。将PCR反应产物送至上海生工测序，测序结果在NCBI上进行Blast比较分析，并与Genbank中的其他菌株基因序列进行同源性比较。
1.4 根表微生物促生能力测定菌株接种到TSA液体培养基中，摇床振荡培养48 h(30 ℃，170 r/min)，活化得到种子液。吸取2 µl种子液分别点接在无氮培养基、CAS检测培养基、无机磷培养基上，封口膜封口后于25 ℃下培养7 d。观察是否出现水解圈，以鉴定菌株的固氮、产铁载体以及溶解无机磷能力。用水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)初步比较菌株促生能力强弱[16]。每个处理设置4个重复。
IAA产生能力测定：按1%的接种量将种子基接入含有5 mmol/L色氨酸的TSA液体培养液中，30 ℃、170 r/min振荡培养48 h后，取1 ml菌液，10 000 r/min离心5 min。取上清液，加入等量Salkawski显色剂，黑暗中显色30 min后用酶标仪测定吸光值(OD530nm)，同时制作浓度为0、10、20、30、40和50 µg/ml的标准曲线，计算IAA浓度[17]。
1.5 根表微生物促生效果验证无菌烟苗制备：烟草种子于75% 酒精浸泡3 ~ 5 min，5% 次氯酸钠再次浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次。无菌种子转移至铺有无菌滤纸的培养皿中，每个皿中加入5 ml无菌蒸馏水。置于培养箱中30 ℃下培养10 d，每48 h检查是否污染杂菌。将发芽的烟苗移栽至灭菌基质中，培养到合适苗龄，用于后续促生效果试验。
无菌土获得：盆栽所用土壤同样是来自于永州市烤烟产区典型烟田土，高温高压灭菌后备用。
菌悬液制备：将上述通过促生能力测定筛选到的菌株进行温室盆栽促生效果验证。菌株种子液以1% 接种量接入到100 ml TSA液体培养基中，30 ℃、170 r/min振荡培养48 h，调整菌液浓度为OD600=1；离心8 min，沉淀用无菌水洗涤一次后重振，定容到50 ml以获得菌悬液。
将苗龄50 d的无菌云烟87幼苗移植装有200 g土壤的无菌纸杯中，每株幼苗根部接种5 ml菌剂，以根部接种5 ml无菌水为对照组(CK)。每种菌株处理设置7个重复，在无菌室中培养，随机摆放并定时改变摆放位置，45 d后测量烟草株高、地下部干物质量等相关促生指标。同时，在烟株收获时挑选部分处理的烟株，获得根系微生物组悬液，利用稀释平板涂布法测定菌株在根部的定殖情况。
1.6 数据处理与统计分析用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 26进行数据处理，并利用GraphPad Prism 8和Origin 2021进行作图。
2 结果与分析 2.1 烟草根表微生物组获取植烟根表共分离纯化出细菌310株，经16S rRNA基因序列比对分析，分离的可培养微生物组主要有变形菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)和放线菌(Actinobacteria)4个细菌门(图 1A)。在4种土壤中，变形菌门均是烟草根表的优势菌门，占总分离菌株的60.0%。纲水平上，4种土壤中的可培养微生物主要包含芽孢杆菌纲(Bacilli)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、放线菌纲(Actinobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)等(图 1B)。其中，从土壤1中分离鉴定出的放线菌门和拟杆菌门明显少于其余3种土壤，而土壤2和土壤3中厚壁菌门分离数量较少。从土壤1和2中分离鉴定γ-变形菌纲的数量明显少于其他两种土壤，而β-变形菌纲呈相反趋势。土壤2中未分离出鞘脂杆菌纲微生物，土壤3中未分离出α-变形菌纲的微生物。
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图 1 不同土壤中烟草根表可培养微生物门(A)和纲(B)水平上的组成 Fig. 1 Compositions of cultivable microbial phylum (A) and class (B) level in tobacco root surface of different soils |
在属水平上，这些可培养微生物组共包括31个细菌属类。其中，变形菌门中的假单胞菌属(Pseudomonas)和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，拟杆菌门中的成对杆菌属(Dyadobacter)，以及厚壁菌门中的芽孢杆菌属(Bacillus)为4种供试土壤植烟根表共有的细菌类群。进一步结合维恩图分析发现，4种代表性土壤中烟草根表微生物群落在属水平上具有较大的差异(图 2)。因此，为更多获得在烟草根表稳定定殖的、具有潜在促生作用的菌株，本研究选取了同时存在于3种及以上土壤中的细菌属类群来进行菌株筛选，对此挑选出代表性菌株共16株，隶属于4个门、6个纲、9个属(表 3)。
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图 2 不同土壤中植烟根表微生物类群Venn图(属水平) Fig. 2 Venn diagram of microbial communities in tobacco root surface of different soils (genus level) |
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表 3 烟草根表分离鉴定的代表性菌株 Table 3 Representative strains isolated and identified from tobacco root surface |
测定结果表明，16株菌中6株有固氮能力，其中菌株YC8表现出较强的固氮能力；有5株菌株具有产铁载体能力，其中YC8和YC15表现出了较强的产铁载体能力；4株菌株可以对无机磷进行溶解，其中YC8、YC9和YC21三株菌株具有较强的解无机磷的能力(表 4)。有4株菌可产IAA，分别是YC1、YC8、YC21、YC36(图 3)。其中菌株YC8产IAA能力最强，菌液中IAA含量为18.40 µg/ml；其次是YC1，菌液中IAA含量为15.27 µg/ml；分泌IAA能力最弱的是菌株YC21，含量为6.50 µg/ml。
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表 4 菌株的促生能力 Table 4 Growth-promoting ability of strains |
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(柱状图上不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)) 图 3 不同供试菌株产IAA能力 Fig. 3 Ability of different tested strains to produce IAA |
将16株菌株进行温室盆栽试验，通过对比烟草苗移栽前和采收后的促生指标的变化(图 4)，YC3、YC4、YC8、YC15、YC17和YC18处理下的烟草在多个指标中都表现出显著促进作用，占总接种菌株的37.5%。与CK处理相较，接种这6株菌株对烟草株高、总鲜物质量和地下部干物质量分别提高35.1%、27.9% 和30.7%。
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(柱状图上的*表示处理组与对照组差异显著(P < 0.05)) 图 4 代表性菌株的促生作用 Fig. 4 Growth promotion of representative strains |
植物根系微域微生物对促进植物生长、防治病害具有重要作用[18-20]。已有研究表明，烟草根系区域有多种不同的微生物类群，是烟草生长发育的关键影响因素[21-22]。周亚男等[23]从不发病烟田中的K326烟草根际分离筛选属于4个门、17个属的可培养微生物160株，其中γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲和β-变形菌纲为主要优势类群，假单胞菌属和芽孢杆菌属是主要优势菌。在本研究中，从湖南省永州市烤烟产区4种代表性土壤的烟草根表分离鉴定出310株可培养细菌，分属于4个门、8个纲、31个属。相较于烟草根际可培养细菌类群，本研究在烟草根表发现了黄杆菌纲和噬纤维菌纲，而γ-变形菌纲、β-变形菌纲和芽孢杆菌纲在根际和根表中共同存在，但相对丰度明显不同，这种差异可能是由烟草根系对微生物的选择所造成。在属水平上，本研究发现多样性更高的根表微生物，而假单胞菌属、寡养单胞菌属、成对杆菌属和芽孢杆菌属为4种供试土壤烟草根表共有的细菌类群。目前有研究表明，很多来自于假单胞菌属和芽孢杆菌属等的菌株能通过溶磷、解钾和产IAA等方式促进烟草的生长[24-25]。因此，烟草根表共有的细菌种群可能包含对烟草健康生长有益的菌株。
为获得的功能菌具有广谱适用性，本研究所选菌株以同时在3种及以上供试土壤中存在为筛选原则，从获得的根表微生物组挑选出代表性菌株进行微生物促生能力测定。结果发现，各微生物菌株在固氮能力、产铁载体能力、无机磷溶解及产IAA均具有一定功能特性，其中假单胞菌属的菌株YC8和YC21促生特性更为突出。孙晓莹等[26]发现假单胞菌属耐盐菌YZX4在不同盐浓度下同时具有较强的ACC脱氨酶活性、IAA合成能力、嗜铁素合成能力、固氮能力和溶磷(有机磷和无机磷)能力。假单胞菌株因具有多种促生能力可能会成为促进植物生长的潜在生物资源。进一步通过盆栽试验发现，有6株菌株在株高、总鲜物质量、地下部干物质量等指标中表现出显著的促进作用，其主要属于假单胞菌属、成对杆菌属、寡养单胞菌属和微杆菌属。因此，除了假单胞菌外，其他菌属也具有很多促进植物生长的细菌类型[27-28]。如，Kumar等[29]分离出Dyadobacter sp.可通过根际生物固氮的方式促进植物氮素的获取。Egamberdieva等[30]发现嗜根寡养单胞菌DSM 14405T能促进植物的生长。同时，假单胞菌属、成对杆菌属和寡养单胞菌属为本研究4种代表性土壤中烟草根表共有的细菌属类，这为改善烟草根区微生态功能提供了依据和新思路。
综上所述，本研究通过烟草根表微生物组进行规模化分离鉴定，并获得了多株具有促生潜力的菌株，为后续应用研究提供了微生物资源和研究思路，也为进一步研究不同微生物之间的协同互作促进植物生长，改善植物根系微观微生物生态功能提供理论基础。
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