2022, Vol. 54
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国科学院流域地理学重点实验室(中国科学院南京地理与湖泊研究所), 南京 210008
土壤微生物是驱动陆地表层生态系统即关键带(Earth’s critical zone)系统生物地球化学循环的引擎，是陆地生态系统的重要组成部分[1]。土壤微生物调控土壤中的物质周转与养分传递，影响地表植物多样性与作物生产，驱动着陆地生态系统诸多生物地球化学过程[2-3]。然而，关于土壤微生物群落特征的研究大多集中在近地表环境，如表层土壤或耕作层土壤，对于深层土壤微生物的认识仍较少[4]。研究表明，尽管深层土壤中的氧气和养分含量都极为有限，但在该区域仍生活着大量而多样的微生物群落[5-6]。此外，深层土壤中的微生物大多具有铁还原或硫酸盐还原等独特的代谢功能，在矿物风化与土壤形成等过程中发挥重要作用[7]。阐明深层土壤中微生物群落特征及其影响因素，对深入探索陆地表层生态系统的生物多样性以及生态系统服务的多功能性具有重要的生态学意义。
环境异质性显著影响土壤微生物的组成与多样性等群落特征。成土环境和成土过程通常会使土壤内部产生差异化的微环境，并导致土体土壤理化属性如质地、孔隙以及矿质养分的异质性，这些差异将进一步影响土壤微生物群落的组成与分布。研究表明，即便是土壤环境中相隔仅几毫米的微距离，土壤的理化属性以及土壤微生物的相对丰度和组成等群落特征也大不相同[8-9]。此外，物种之间的相互作用也会影响土壤微生物群落特征。土壤中的微生物不能孤立生活，而总是与其他微生物发生着共生、寄生、捕食或是竞争等多种相互作用，从而构成复杂的微生物生态网络，这些物种之间的相互作用关系会对群落的物种组成和结构产生不同影响，并最终影响土壤微生物所行使的生态学功能。事实上，大多数生态学功能如养分循环或污染物降解等过程都无法由单一物种完成，而是多个物种之间相互作用关系的结果。因此，探究不同土壤环境中物种之间的相互作用关系，为更好地理解复杂生态学过程和生态系统的服务功能提供了科学依据[10]。基于高通量测序技术，利用网络分析的方法可以间接揭示微生物群落物种之间潜在的相互作用关系。目前，网络分析方法已被成功应用于挖掘土壤、湖泊、地下水和活性污泥等生态系统中微生物的相互作用模式研究[11-12]。
广泛分布于我国南方亚热带地区的网纹红土是红壤关键带地下部的典型结构之一，一般出现在均质红土剖面的下方，红砂岩(基岩)的上方，是第四纪红色风化壳的重要组成部分。作为第四纪古气候和古环境条件下的特殊产物，网纹红土中包含着重要的环境变化信息，在全球环境变化的研究中具有极高的研究价值[13]。在历史气候与复杂的成土过程的综合作用下，较为强烈的氧化还原和风化淋溶过程不断发生，土体中铁的非均质迁移和淋失以及脱硅富铝化的持续进行，形成了在野外易于辨认的红白相间的网纹土体结构[14]。网纹红土的形成和发育过程记录了环境的变化信息，对网纹红土结构的沉积学、环境学和生态学等特征进行解读可以为第四纪环境的研究提供重要的科学依据。近年来，研究人员从不同角度对网纹红土做了大量的科学研究，包括分析其物质来源以解析网纹的成因、形成年代和古气候指示意义等方面，但并未有对网纹红土结构的土壤生态学特别是土壤微生物学方面的相关研究。而由于风化和成土过程导致的网纹层独特的红白土体很可能会形成独特的微环境，并进一步形成差异化的生态位，从而影响其上微生物群落的组成以及微生物生态网络。
为揭示独特的红白相间的网纹土体结构内微生物群落组成、多样性及生态网络特征，本文以网纹红土结构体为研究对象，按照土体颜色将网纹结构体拆分成红色基质和白色网纹两部分，利用微生物16SrRNA高通量测序技术研究网纹红土结构体红/白部分细菌群落的组成与多样性等特征。基于测序所获取的数据集，利用CoNet(Co-occurrence network)网络构建方法挖掘红/白部分细菌间的相互作用关系，并结合网纹土体的理化属性探讨网纹结构体细菌群落特征的影响因素。
1 材料与方法 1.1 研究区概况与样品采集研究区位于江西省鹰潭市的红壤关键带观测平台(red soil critical zone observatory, RSCZO)。红壤关键带观测平台设于鹰潭市余江县刘家站垦殖场的孙家小流域(116°53′ E, 28°14′ N)，流域总面积51.25 hm2，流域内地势平坦，坡度在3 ~ 5°，海拔在41 ~ 55 m，主要地貌类型为低山丘陵。研究区气候类型为中亚热带季风湿润气候，年平均温度17.5 ℃，年平均降水量约1 795 mm。基于本研究的研究目的，在流域内选择了一个典型样点，该样点的土地利用方式为水稻田。红壤关键带位置以及样点位置如图 1所示。
|
图 1 研究区(红壤关键带)位置与样点位置(BH2) Fig. 1 Location of study area of Red Soil Critical Zone (RSCZO) and sampling site (BH2) |
利用液压旋转钻机取样。该样点网纹土体的深度范围为1.4 ~ 5.0 m。将网纹样品等间距(20 cm)分割，放入自封袋置于便携式冰箱带回实验室。采样时间为2016年4月，本研究共采集网纹样品18段。在实验室无菌的环境中，利用灭菌的塑料镊子小心将成段网纹样品的红色基质部分和白色网纹部分剥离开，分别收集红色和白色部分，获取样品共36个。网纹红土的出露位置、形态以及拆分后的网纹样品如图 2所示。
|
图 2 网纹红土的位置、网纹的微形态和拆分后的网纹结构 Fig. 2 Position and micromorphology of plinthite horizon, and separated red matrix and white veins |
网纹结构体的红白部分有机碳含量(SOC)用重铬酸钾–硫酸消化法测定；全氮(TN)含量用硒粉、硫酸铜、硫酸钾消化蒸馏–凯氏定氮法测定；颗粒组成用激光粒度仪法测定；矿质全量的测定选择碳酸锂–硼酸熔融–电感耦合等离子体质谱法测定；游离铁含量的测定用柠檬酸钠–连二亚硫酸钠提取，电感耦合等离子质谱法测定。
1.3 DNA提取与高通量测序选择FastDNA Spin Kit for soil提取试剂盒(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)，按照操作指南提取网纹红/白部分微生物总DNA。DNA提取后利用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE)在波长为260/280 nm处测定提取的DNA的浓度与质量。
对符合质量要求的DNA目标片段进行PCR扩增，扩增反应的目标片段为细菌的16S rRNA的可变区V4 ~ V5区。PCR扩增反应所用的引物是带有barcode的通用引物515F (5’-GTGCCAGCMGCCG CGG-3’)和907R (5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT- 3’)。PCR反应体积共20 μl，其中包括10 ng DNA模板，2.5 μl 2.5 mmol/L的dNTP，两端引物各0.8 μl，以及0.4 μl的Fast Pfu DNA聚合酶等。PCR反应总共进行25个循环，总的反应流程为：95 ℃预变性反应3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，以及在72 ℃延伸保温10 min。
测序平台选择Illumina MiSeq PE250 Platform，通过对原始序列过滤、序列拼接和去除嵌合体等，得到高质量序列，并在97% 相似度水平上对操作分类单元(OUT)进行聚类与划分，获得基于序列的OUT。
1.4 数据处理方差分析用SPSS 19.0进行，典范对应分析(CCA)、主坐标分析(PCoA)以及多元方差分析(PermANOVA)分析均使用R软件(R version 4.0.0)的“Vegan”包进行。
微生物生态网络构建方法参考Karoline Faust开发的基于相关/相似性的社会复杂网络分析的Co-occurrence network (CoNet)网络分析方法，在Cytoscape version 3.4.0平台上运行[15-16]。在相似/相关性方法中，本研究选择了Pearson correlation、Spearman correlation、Bray-Curtis dissimilarity和Kullback-Leibler dissimilarity 4种方法。获取初始网络后，利用Benjamini-Hochberg方法对获得的相关系数进行标准化处理，并对相关关系的P值进行校正，保留校正后P < 0.05的连线构建最终的网络。为统计网络的拓扑学属性差异，本文过滤并提取了每一网纹结构体样品对应的子网络，利用Network Analyzer分析子网络的拓扑特征。
2 结果与讨论 2.1 网纹红土结构土壤理化属性差异网纹土体结构红白部分的理化属性如表 1和表 2所示。矿质全量中铁和锰在网纹红色部分的含量显著高于白色部分，硅含量在网纹的白色部分较高。网纹红土结构体红白部分理化性质的差异与网纹的形成过程密切相关。在干湿交替的情况下，氧化还原过程是网纹形成的主要成土过程之一。网纹层中的红色部分倾向于氧化环境，含有较多高价态的铁氧化物如赤铁矿等，所以该部分土体呈现红色；在网纹结构体的白色部分，由于水分的作用，在还原的条件下，三价铁矿物被还原成二价铁并沿着裂隙不断迁移，并伴随着氧气和养分的消耗，钾、钙、钠、镁等矿质元素的淋失也更强烈。网纹结构体理化属性的分析也指示红色基质部分可能是一个矿质养分相对丰富的微环境。
|
表 1 网纹红土结构红、白部分理化属性(g/kg) Table 1 Physiochemical properties of red matrix and white veins in plinthite horizon |
|
|
表 2 网纹红土结构红、白部分土壤机械组成(V/V，%) Table 2 Particle size distribution of red matrix and white veins in plinthite horizon |
细菌相对丰度分析结果表明，在网纹的红色部分，放线菌门(Actinobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)等的相对丰度要显著高于白色部分。而在网纹的白色部分，酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、GAL15和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)的相对丰度则较高(图 3)。PermANOVA结果表明，网纹的红白部分细菌群落组成差异显著(P = 0.001)。
|
图 3 网纹红土结构红、白部分细菌主要门/纲的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of main phylum or class in red matrix and white veins in plinthite horizon |
酸杆菌门)是一种典型的寡营养细菌，它们能够利用几丁质等难分解的碳源作底物，在养分有限的情况下依然具有生存力[17]。此外，硝化螺旋菌门的相对丰度在白色部分也较高，该门类中含有大量参与硫酸盐还原的寡营养厌氧细菌，因此更适合生活在矿质
养分含量较低的白色网纹部分[18]。而在红色基质中丰度较高的γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)是典型的富营养细菌。这可能是因为，网纹结构体的白色部分由于长期的还原作用，元素的淋失和消耗都更强烈，为细菌提供了一个养分有限的还原性环境，因此酸杆菌门等寡营养细菌可以富集在白色网纹中。而对于红色基质部分，相对弱的淋失过程提供给细菌一个矿质养分较丰富的生态环境，使放线菌门)和γ-变形菌纲等细菌可以富集在网纹的红色部分。
2.3 网纹红土结构土壤细菌生态网络本研究分别构建了网纹结构体红色基质和白色网纹部分细菌间相互作用关系的生态网络，网络构建的结果如图 4所示。为统计分析红、白部分细菌生态网络的拓扑参数是否具有差异，本研究进一步提取了网纹结构体中每个样品对应的子网络。
|
图 4 网纹红土结构红、白部分细菌生态互作网络 Fig. 4 Co-occurrence network of red matrix and white veins in plinthite horizon |
利用Network Analyzer分析提取每个独立样品子网络的拓扑学特征，结果表明，网纹的白色部分细菌生态互作网络节点数目和连线数目都显著高于红色部分，细菌之间的负连线数目也显著高于红色部分。而网纹红色部分的网络聚类系数显著高于白色部分(图 5)。
|
图 5 网纹红土结构红、白部分细菌生态网络的拓扑学性质 Fig. 5 Topological features of co-occurrence network of red matrix and white veins in red matrix and white veins in plinthite horizon |
生态网络的拓扑学性质可以在一定程度上反映网络所代表的生态系统中物质流、能量流以及信息流的流畅程度等。网络的聚类系数代表网络中一个节点和其他节点之间的连通程度，聚类系数越高表示群落对环境变化的敏感性越强，当外界环境发生变化时，环境因子的扰动通常会在较短的时间内影响整个网络[19]。研究表明，网纹结构体的红色基质部分细菌生态网络的聚类系数较高，说明该部分细菌之间相互作用关系更紧密。而在白色网纹部分，较低的聚类系数则代表细菌生态网络结构比较松散，网络内细菌之间的相关关系对比于红色部分相对较弱。
2.4 网纹红土结构土壤细菌群落的影响因素典范对应分析结果表明，网纹红土结构红、白部分细菌群落的差异是由于红、白部分的微环境异质性决定的。受第四纪古气候的影响，地下水的上下波动和季节性的干湿交替造成矿质元素包括钾、钙和钠等元素的强烈淋溶和铁、铝等元素不断积累。由于网纹结构体一般出现在均质红土剖面的下方，所以能接收到的地表输入的养分极为有限，因此，矿物所含有的矿质养分是微生物生存的生命资源，是显著影响微生物群落组成的重要因素[20-22]。在本研究中，矿质全量中的铁和锰含量与网纹结构体红色基质部分的细菌群落显著相关。铁是地壳中含量第四高的元素，亚铁和三价铁之间的氧化还原过程是红壤关键带生态系统生物地球化学循环中的重要过程之一，同时也深刻地影响着红壤地区土壤的发生与演变过程。而土壤和沉积物中亚铁和三价铁之间的氧化还原过程常常由土壤细菌主导，白色网纹中发现的Geobacter、Desulfurspora和Shewanella等细菌都是典型的三价铁还原细菌[23-24]。此外，网纹结构体的机械组成也显著影响红、白部分细菌群落的分布。机械组成代表的质地状况是土壤的重要物理属性之一，同时也代表了土体的水文状况[25]。而在深部的网纹层土壤中，土体的水文状况不只与网纹的形成和发育有关，也决定了养分状况，因而对细菌群落有显著影响[26]。
|
图 6 网纹红土结构土壤理化属性与细菌群落结构的典范对应分析 Fig. 6 Canonical correspondence analysis of bacterial communities and soil properties for all samples from red matrix and white veins in plinthite horizon |
网纹红土结构是第四纪红色风化壳的重要组成部分，对研究第四纪古气候和古环境变迁至关重要。网纹结构体内部红、白部分细菌群落组成具有显著差异，这些差异主要是由网纹土体中红、白部分的环境条件差异决定。本研究探索性地将网纹结构进行拆分，分别对不同部分的细菌群落特征进行分析，研究结果对认识红壤关键带深部生态系统的生物多样性和多功能性具有重要的生态学意义。
| [1] |
National Research Council. Basic research opportunities in earth sciences[M].
National Academies Press, Washington DC, 2001
(  0) |
| [2] |
Williams J W, Jackson S T, Kutzbach J E. Projected distributions of novel and disappearing climates by 2100 AD[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(14): 5738-5742 DOI:10.1073/pnas.0606292104 ( 0) |
| [3] |
Wilkinson M T, Richards P J, Humphreys G S. Breaking ground: Pedological, geological, and ecological implications of soil bioturbation[J]. Earth-Science Reviews, 2009, 97(1/2/3/4): 257-272 ( 0) |
| [4] |
Fierer N, Schimel J P, Holden P A. Variations in microbial community composition through two soil depth profiles[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2003, 35(1): 167-176 DOI:10.1016/S0038-0717(02)00251-1 ( 0) |
| [5] |
Amend J P, Teske A. Expanding frontiers in deep subsurface microbiology[J]. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology, 2005, 219(1/2): 131-155 ( 0) |
| [6] |
Whitman W B, Coleman D C, Wiebe W J. Prokaryotes: The unseen majority[J]. PNAS, 1998, 95(12): 6578-6583 DOI:10.1073/pnas.95.12.6578 ( 0) |
| [7] |
Gleeson D, Mathes F, Farrell M, et al. Environmental drivers of soil microbial community structure and function at the Avon River Critical Zone Observatory[J]. Science of the Total Environment, 2016, 571: 1407-1418 DOI:10.1016/j.scitotenv.2016.05.185 ( 0) |
| [8] |
杜雄峰, 厉舒祯, 冯凯, 等. 农牧交错带草地土壤剖面微生物总量、多样性和互作网络的垂直分布特征[J]. 微生物学通报, 2020, 47(9): 2789-2806 DOI:10.13344/j.microbiol.china.200465 ( 0) |
| [9] |
Brockman F J, Murray C J. Subsurface microbiological heterogeneity: Current knowledge, descriptive approaches and applications[J]. FEMS Microbiology Reviews, 1997, 20(3/4): 231-247 ( 0) |
| [10] |
Xiao X, Liang Y T, Zhou S, et al. Fungal community reveals less dispersal limitation and potentially more connected network than that of bacteria in bamboo forest soils[J]. Molecular Ecology, 2018, 27(2): 550-563 DOI:10.1111/mec.14428 ( 0) |
| [11] |
Barberán A, Bates S T, Casamayor E O, et al. Using network analysis to explore co-occurrence patterns in soil microbial communities[J]. The ISME Journal, 2012, 6(2): 343-351 DOI:10.1038/ismej.2011.119 ( 0) |
| [12] |
Ju F, Zhang T. Bacterial assembly and temporal dynamics in activated sludge of a full-scale municipal wastewater treatment plant[J]. The ISME Journal, 2015, 9(3): 683-695 DOI:10.1038/ismej.2014.162 ( 0) |
| [13] |
Liu C C, Deng C L, Liu Q S. Mineral magnetic studies of the vermiculated red soils in southeast China and their paleoclimatic significance[J]. Paleogeography, Palaeoclimatology, Paleoecology, 2012, 329/330: 173-183 DOI:10.1016/j.palaeo.2012.02.035 ( 0) |
| [14] |
Gu Y S, Huang X Y, Zhang W G, et al. Red paleosols development in response to the enhanced east Asia summer monsoon since the mid-Pleistocene in South China: Evidence derived from magnetic properties and molecular fossil records[J]. Journal of Earth Science, 2013, 24(3): 382-396 DOI:10.1007/s12583-013-0331-4 ( 0) |
| [15] |
Faust K, Raes J. CoNet app: Inference of biological association networks using Cytoscape[J]. F1000Research, 2016, 5: 1519 DOI:10.12688/f1000research.9050.1 ( 0) |
| [16] |
Smoot M E, Ono K, Ruscheinski J, et al. Cytoscape 2.8: New features for data integration and network visualization[J]. Bioinformatics, 2011, 27(3): 431-432 DOI:10.1093/bioinformatics/btq675 ( 0) |
| [17] |
Tsitko I, Lusa M, Lehto J, et al. The variation of microbial communities in a depth profile of an acidic, nutrient-poor boreal bog in southwestern Finland[J]. Open Journal of Ecology, 2014, 4(13): 832-859 DOI:10.4236/oje.2014.413071 ( 0) |
| [18] |
Attard E, Poly F, Commeaux C, et al. Shifts between Nitrospira- and Nitrobacter-like nitrite oxidizers underlie the response of soil potential nitrite oxidation to changes in tillage practices[J]. Environmental Microbiology, 2010, 12(2): 315-326 DOI:10.1111/j.1462-2920.2009.02070.x ( 0) |
| [19] |
Chow C E T, Kim D Y, Sachdeva R, et al. Top-down controls on bacterial community structure: Microbial network analysis of bacteria, T4-like viruses and protists[J]. The ISME Journal, 2014, 8(4): 816-829 DOI:10.1038/ismej.2013.199 ( 0) |
| [20] |
Uroz S, Kelly L C, Turpault M P, et al. The mineralosphere concept: Mineralogical control of the distribution and function of mineral-associated bacterial communities[J]. Trends in Microbiology, 2015, 23(12): 751-762 DOI:10.1016/j.tim.2015.10.004 ( 0) |
| [21] |
Roberts J A. Inhibition and enhancement of microbial surface colonization: The role of silicate composition[J]. Chemical Geology, 2004, 212(3/4): 313-327 ( 0) |
| [22] |
Carson J K, Gonzalez-Quiñones V, Murphy D V, et al. Low pore connectivity increases bacterial diversity in soil[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(12): 3936-3942 DOI:10.1128/AEM.03085-09 ( 0) |
| [23] |
Lovley D R. Dissimilatory Fe(III) and Mn(IV) reduction[J]. Microbiological Reviews, 1991, 55(2): 259-287 DOI:10.1128/mr.55.2.259-287.1991 ( 0) |
| [24] |
Weber K A, Achenbach L A, Coates J D. Microorganisms pumping iron: Anaerobic microbial iron oxidation and reduction[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(10): 752-764 DOI:10.1038/nrmicro1490 ( 0) |
| [25] |
Wallis M G, Scotter D R, Horne D J. An evaluation of the intrinsic sorptivity water repellency index on a range of New Zealand soils[J]. Soil Research, 1991, 29(3): 353 DOI:10.1071/SR9910353 ( 0) |
| [26] |
Girvan M S, Bullimore J, Pretty J N, et al. Soil type is the primary determinant of the composition of the total and active bacterial communities in arable soils[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(3): 1800-1809 DOI:10.1128/AEM.69.3.1800-1809.2003 ( 0) |
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Key Laboratory of Watershed Geographic Sciences, Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China