2. 中国科学院大学, 北京 100049
钾是植物体内含量最丰富的矿质营养元素,约占植物干物质量的2% ~ 10%,甚至更高,在植物的整个生长发育过程中起着至关重要的作用[1-2]。K+参与植物体内的多种生理活动,如:维持细胞电荷平衡及渗透调节、影响蛋白质的合成及同化产物分配与运输、保障碳氮代谢酶活性、促进植物进行光合作用、调节叶片气孔运动、参与花粉管伸长生长及果实成熟发育等,另外在提高作物抵抗生物和非生物胁迫等方面也有重要贡献[3]。
土壤是植物获取钾素的主要来源,我国由于地形、土壤质量及长期耕作等诸多原因,土壤根际的钾含量通常在0.1 ~ 1 mmol/L范围内波动[4],加之土壤耗竭和不可交换钾等因素以及可交换性钾的释放速率显著慢于植物吸收钾的速率,导致土壤中可吸收的钾含量越来越低[5],耕地土壤缺钾成为长期困扰我国农业生产的严重问题之一[6]。对农作物而言,土壤溶液中钾浓度要达到1 mmol/L以上时才能基本满足植物的生长需要[7],为保证作物的高产和优质,不得不外源施用足量的钾肥,以保证土壤钾含量达到满足植物基本生长需求的钾水平[8]。由此可见,提高供钾后植物的钾素利用效率尤为重要。另一方面,我国钾矿资源相对匮乏,根据无机盐工业协会的预测,未来十年我国钾肥的供需缺口仍将保持在300 ~ 400万t左右,虽然我国钾肥需求对外依存度由2000年的83.0% 下降到2008年的62.9%,但仍为世界第一大钾肥消费国和进口国[9]。因而通过改良作物的钾营养性状提高其对钾素的利用效率,成为近年来农学、植物营养学等研究领域应对农业生产钾肥供需矛盾的重要举措之一。
植物从生长环境中获取K+以及K+在植物细胞间的转运和分配主要是通过定位于质膜上的钾吸收系统包括K+通道和K+转运体介导的[10]。通常,在K+浓度较低(低于1 mmol/L)的条件下,主要由高亲和的钾吸收系统即钾转运体起重要作用,而在高钾浓度(大于1 mmol/L)条件下,低亲和的钾吸收系统即K+通道则发挥重要功能[3, 11]。不过,近年来已有不少研究表明,只要质膜处于足够超级化状态(如胞内有足量的负电荷时),即使处于低钾条件,被定义为低亲和的K+通道也可参与高亲和的钾吸收[12-13],表明K+通道在植物生长发育过程中起主导性作用。20世纪80年代,Schroeder等[14]利用膜片钳技术在蚕豆(Vicia faba)的保卫细胞中首次发现K+通道的存在。1992年,Sentenac等[15]和Anderson等[16]分别通过酵母钾吸收突变体钾吸收功能互补的方法,从拟南芥中率先克隆到KAT1和AKT1两个K+通道基因。迄今已有大量K+通道从不同植物中得以克隆和鉴定[3, 10, 17-18]。根据蛋白序列和结构特征将K+通道划分为3个类型:Shaker型、TPK型和Kir-like型,其中Shaker型通道被认为是介导植物K+吸收、转运和细胞内动态平衡最为重要的一类通道[18]。
一个完整的Shaker型K+通道是由4个蛋白亚基围绕而成的四聚体,每个亚基都含有一个N端、6个跨膜区(S1 ~ S6)及一个C端,N端和C端均位于胞质内。其C端至少含有两个区域,包括一个环核苷酸结合区(cyclic nucleotide-binding domain, cNBD)和一个富含疏水酸性残基的KHA域[19],大多数Shaker型K+通道的C端cNBD和KHA之间还包含一个锚蛋白区(ankyrin-related domain, ANK)[18]。根据植物Shaker K+通道的序列、基因结构和功能特征,又将其分为5个亚组:GroupⅠ(AKT1亚家族)、GroupⅡ(KAT亚家族)、GroupⅢ(AKT2亚家族),Group Ⅳ(AtKC1亚家族)、GroupⅤ(SKOR/GORK亚家族)[18]。GroupⅠ中,以AKT1为代表,多在植物从土壤中获取钾的过程中发挥作用[20];Group Ⅳ以AtKC1为代表,主要调控K+吸收通道从而辅助根系对钾的吸收[21];GroupⅡ中主要是气孔开放型K+吸收通道,KAT1和KAT2主要在气孔保卫细胞中表达,缺失这两个通道则导致气孔无法开放[22],并与外向整流型通道GORK共同参与气孔运动的调控[23];Group Ⅲ中,以弱整流性通道AKT2为代表,主要在韧皮部表达,其通过介导K+在韧皮部的装载或卸载实现K+在植株体内的长距离运输;GroupⅤ中的外向K+通道SKOR将钾朝向中柱疏导组织分泌,再以质流的方式向地上部运输。缺失AtSKOR基因的拟南芥地上部组织的含钾量降低约50% [24],这些研究都凸显了K+通道对植物生长发育的关键作用。
近年来,通过在植物中过表达K+通道研究其生理意义的报道逐渐增多[25-31],不过这些研究的尝试主要聚焦于根系吸收或根茎长距离传输的K+通道(内向整流型AKT亚家族和外向整流型SKOR亚家族)。而关于叶片气孔类K+通道,尤其是对源于光合效率强大的C4植物,如玉米等的气孔调控型K+通道钾素利用效率的研究相对较少。本研究从玉米(Zea mays)郑丹958中克隆了KAT1型K+通道ZmK2.1,并在拟南芥中过表达ZmK2.1,通过筛选获得了转ZmK2.1的过表达拟南芥纯系植株;通过比较不同供钾水平下,过表达ZmK2.1拟南芥的根长、生物量、钾含量、钾积累量以及光合效率等指标,明确玉米气孔开放型K+通道ZmK2.1的钾素利用特征,从基因工程角度为提高植物的钾素利用效率提供有益的证据。
1 材料与方法 1.1 过表达ZmK2.1拟南芥材料的创制 1.1.1 K+通道ZmK2.1的聚类分析为进一步明确ZmK2.1所属的K+通道类型,本研究从plant membrane protein database检索了13种植物包括拟南芥、水稻、玉米、大豆、甜瓜、胡萝卜、葡萄、马铃薯、沙冬青、苜蓿、小花碱茅、黄瓜及杨树中已经有明确功能机制报道的Shake型K+通道的氨基酸序列,其中ZmK2.1的序列参照Su等[32]的报道。利用MEGA11.0软件构建系统发育进化树,利用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对分析。
1.1.2 过表达ZmK2.1拟南芥材料载体的构建以实验室保存的pCambia1301-35s-nos为过表达载体骨架,以玉米郑丹958的cDNA为模板,参照Su等[32]报道的ZmK2.1的CDS序列,并通过CE Design在线引物设计软件设计特异引物Zmk2-1-BamHI-P1 (ggacagggtacccggggatccATGACTCAAGCTAATTCAAAGTCATGC)和Zmk2-1-XbaI-P2 (cgcctgcaggtcgactct agaCTACATCTGAAGAAGGAATAGGTGGTC) 进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μl:高保真酶混合物2×Phanta Max Master Mix(Vazyme, 货号P515-01)为25 μl,上、下游引物(10 μmol/μL)各为1 μl,模板为1 μl,加水补齐至50 μl。PCR反应程序:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。琼脂糖凝胶回收ZmK2.1片段,并通过Bam HI和Xba I酶切位点将ZmK2.1基因构建到过表达载体pCambia1301-35s-nos上,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,挑选阳性克隆委托南京擎科生物科技有限公司进行测序,确定获得正确的含玉米ZmK2.1 cDNA的过表达转基因载体pCambia1301-35s-nos- ZmK2.1。
1.1.3 过表达ZmK2.1拟南芥纯系材料的筛选将pCambia1301-35s-nos-ZmK2.1转入农杆菌Gv3101中,挑选阳性克隆侵染开花盛期的野生型拟南芥Col-0花序,侵染的植株收获种子后,播种于含50 mg/L Hygromycin的MS固体培养基进行筛选,经过连续两代筛选和鉴定,最终获得转基因过表达ZmK2.1拟南芥纯系材料,进行后续试验。
1.2 植物材料的培养 1.2.1 固体培养基培养选取过表达ZmK2.1拟南芥纯系材料OE#3、OE#5、OE#11,以及野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia,Col-0)为对照,用75% 乙醇+0.1% SDS (十二烷基硫酸钠)消毒10 min,无水乙醇清洗两次,每次2 min。吹干后置4 ℃低温避光保存48 h,然后播种于培养基(10 cm×10 cm)上密封好。将培养皿直立地置于光照培养箱中,让根沿琼脂表面向下生长。
固体培养基组成:2 mmol/L NH4Cl、2 mmol/L NaNO3、1 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L MgSO4、250 mol/L K2SO4、250mol/L CaCl2、100 mol/L 2Na-Fe-EDTA、50mol/L KCl、50 mol/L H3BO3、5mol/L MnSO4、1 mol/L ZnSO4、1 mol/L CuSO4、1 mol/L Na2MoO4、0.5 g/L MES-KOH(2-码啉已磺酸)、1%(m/V)蔗糖、0.8%(m/V)琼脂,NaOH调pH至5.8。
光照培养箱的温度为(23±1) ℃,光周期为16 h光照、8 h黑暗,光照强度为400 umol/(m2·s),相对湿度为70%。在固体培养基生长7 d后挑选长势一致的拟南芥植株,分为3组进行处理。
1.2.2 水培培养经过消毒春化的拟南芥种子,用牙签点至内置湿润海绵的去底离心管中蒸馏水萌发。待长出两片针叶后上水培营养液,水培培养液中不含有蔗糖和琼脂,其他成分及培养条件与固体培养基相同。营养液每3 d更换一次。水培培养21 d后,挑选长势一致的拟南芥植株,分为3组进行处理。
1.2.3 不同供钾条件下的表型观测选取饱满适量的拟南芥种子经消毒,低温处理2 d后均匀布于固体培养基上,放入23 ℃光照培养箱中培养6 d。随后选取生长较为一致的拟南芥幼苗,分别移至不同钾浓度的培养基上,继续培养7 d后观察表型并照相记录表型变化。
固体培养基处理条件如下:①LK(低钾)0.1 mol/L KCl;②MK(中钾)1 mol/L KCl;③HK(高钾)10 mol/L KCl,以KCl为唯一钾源。其他成分相同:2 mmol/L NH4Cl、2 mmol/LNaNO3、1 mmol/L NaH2PO4、1 mmol/L MgSO4、250 mol/L CaCl2、100 mol/L 2Na-Fe-EDTA、50 mol/L H3BO3、5 mol/L MnSO4、1mol/L ZnSO4、1 mol/L CuSO4、1 mol/L Na2MoO4、0.5 g/L MES-KOH(2-码啉已磺酸)、1% (m/V)蔗糖、0.8%(m/V)琼脂,NaOH调pH至5.8。每个处理设置60个重复,处理7 d后收样,测定统计相关生理指标。
水培试验处理条件:不含有蔗糖和琼脂,其他成分与固体培养基相同。营养液每3 d更换一次。每个处理8个重复,处理14 d后收样,测定相关生理指标。
1.3 生理指标的测定 1.3.1 拟南芥对不同供钾条件的响应固体培养基试验不同供钾条件处理的植株,收样前拍照记录表型。然后测定植株根长,称量鲜物质量。每个处理重复60次,计算平均值和标准误差。
水培试验不同供钾条件处理的植株,收样时拍照记录表型,收获各植株并称量鲜物质量,然后用双蒸水润洗两次后擦干;经消煮(H2SO4-H2O2消煮法)后采用火焰光度计测全钾含量。
1.3.2 光合指标的测定采用LI-cor公司(美国) 生产的Licor-6400型便携式光合作用测定系统,测定气孔导度、净光合速率、蒸腾速率。测定时将样本室CO2浓度设定为CO2 (400±1) μmol/mol,CO2由系统内置的CO2注入系统提供。叶片温度设定为(23±0.5) ℃,相对湿度70% ± 1%。设置红蓝光源LED,测定前对待测叶片诱导30 min,诱导条件为叶室温度23 ℃,光强750 mol/(m2·s),待仪器读数稳定后,进入自动测定程序。
1.4 数据处理与分析数据使用SPSS 16.0软件进行统计分析,采用独立样t-检验分析不同供钾浓度处理条件下不同株系各项指标的差异显著性。多重比较采用Duncan法,差异显著水平为5%。使用Sigma Plot 12.5软件绘图。
2 结果与分析 2.1 ZmK2.1基因的生物信息学聚类分析结果Shaker家族K+通道数量众多,分为5个亚家族,在植物中的分布呈现出多样性,有的存在于特定的植物器官中,有的则广泛分布在植物的各个组织中。通过对来源于几个不同物种的多种K+通道的氨基酸序列比对分析,发现ZmK2.1属于GroupⅡ(KAT1亚家族),是内向整流型K+通道,与已报道的气孔类K+通道OsKAT3、OsKAT2、OsKAT1、AtKAT1、AtKAT2等聚为一类(图 1)。
进一步分析结果表明,ZmK2.1与AtKAT1、AtKAT2、OsKAT3、KST1、MIRK等气孔开放类K+通道的关键结构域氨基酸序列高度相似,都有6个跨膜结构域和1个通道孔区域、1个环核苷酸结合区(cNBD)和1个富含疏水酸性残基的KHA域,同源性62.8%,表明ZmK2.1属于气孔类K+吸收通道(图 2)。为研究ZmK2.1的钾素利用特征,通过构建过表达转基因载体pCambia1301-35s-nos-ZmK2.1(图 3),利用农杆菌侵染法转入拟南芥Col-0中,连续筛选两代后获得了纯系转基因材料(overexpression: OE)OE#3、OE#5、OE#11,进行后续试验。
低钾条件下,过表达ZmK2.1拟南芥株系与对照(后文所有Col-0均称为对照)的生物量并没有显著差异。中钾条件下,与对照相比,OE#3、OE#5、OE#11的生物量分别增加了6.0%、4.5% 和3.8%,根长分别增加了5.93%、3.4% 和5.5%;高钾条件下,OE#3、OE#5、OE#11的生物量也显著增加,与对照相比分别增加了7.6%、5.2% 和5.1%,根长分别增加了4.5%、8.9% 和9.0%(图 4)。表明在钾充足条件下,过表达ZmK2.1基因可促进植株生长。
为深入了解不同供钾条件下过表达ZmK2.1拟南芥的生长特征及钾素利用特征,进一步设置水培试验进行观测,每隔3 d对培养罐中的营养液进行更换。研究结果表明,与固体培养基试验结果类似,在低钾条件下过表达ZmK2.1株系与对照的地上部生物量没有显著差异;中钾条件下,OE#3、OE#5、OE#11的地上部生物量与对照相比显著增加,分别增加了11.3%、11.3% 和12.9%;高钾条件下,与对照相比分别增加了14.9%、18.6% 和20.0%(图 5B)。表明在钾充足条件下过表达ZmK2.1基因可促进植株生长。
不同供钾水平培养14 d后,测定植物地上部钾元素的含量。过表达ZmK2.1株系与对照相比,地上部含钾量在低钾条件下没有显著差异;中钾条件下,与对照比较,过表达ZmK2.1株系地上部含钾量分别增加10.8%、17.5%、15.8%;高钾条件下,OE#3、OE#5、OE#11的地上部含钾量与对照相比分别增加了20.0%、10.6%、23.5%(图 6A)。在低钾条件下,过表达ZmK2.1株系与对照相比地上部钾积累量没有显著差异;中钾条件下,与对照相比较,OE#3、OE#5、OE#11的地上部钾积累量分别增加了28.5%、15.3%、32.5%;高钾条件下过表达ZmK2.1株系地上部钾积累量显著增加,与对照相比分别增加了40.1%、42.1% 和52.4%(图 6B)。表明过表达ZmK2.1基因可以在钾充足条件下促进拟南芥植株吸收并积累钾元素。
进一步的测定结果表明,与对照相比,过表达ZmK2.1拟南芥植株的光合特征,OE#5、OE#11的气孔导度分别增加了40.2% 和26.5%(图 7A),净光合速率分别增加了24.3% 和17.5%(图 7B),蒸腾速率分别增加了49.9% 和27.1%(图 7C)。表明过表达ZmK2.1的拟南芥气度导度增强,进而提高了植株的光合速率和蒸腾速率。
K+是植物体内含量最丰富的阳离子,在植物生长发育过程的许多生理生化反应中起关键作用。在土壤中,植物根系表面的可利用钾浓度较低,是导致植物缺钾及叶片发黄、生长缓慢等症状发生的主要原因[33]。植株缺钾会导致茎秆的节间长度和茎秆直径减小,从而使得茎秆的稳定性下降,植株易倒伏,抗病抗逆性都降低,果实的产量和品质变差[34]。通过基因操作过表达调控K+通道以提高植物钾素利用效率成为近年来的一个重要研究方向。
众多结果表明,通过过表达K+通道基因可增加植物对钾的吸收和转运效率。在水稻中过表达OsAKT1可提高组织钾含量并增强对植株低钾及干旱胁迫下的耐受性[25];施卫明等[35]将拟南芥K+通道基因AKT1和KAT1转入水稻后,转基因植株的钾吸收速率和对钾的累积能力都有明显的增强,钾积累量增加4% ~ 24.3%。过表达棉花GhAKT1基因的拟南芥可促进低钾胁迫下转基因苗的生长并提高植株对K+的吸收能力[27];甜瓜CmMIRK及CmSKOR的过表达拟南芥植株可促进植株的钾积累并提高其耐盐性[28, 29]。这些研究的尝试主要关注根系吸收或根茎长距离传输的K+通道,而关于气孔类K+通道钾素利用效率方面的研究相对较少。本研究利用转C4植物玉米的气孔开放型K+通道基因ZmK2.1拟南芥研究植株的钾素利用特征,试验结果表明在低钾条件下,过表达ZmK2.1拟南芥的生长和钾素特征与对照相比没有显著差异,而在充足供钾(1 mmol/L K+和10 mmol/L K+)条件下,过表达ZmK2.1拟南芥植株的生物量、钾含量及植株钾积累量较对照相比均显著增加。中钾条件下地上部生物量增加11.3% ~ 12.9%(图 5B),钾含量增加10.8% ~ 17.5%(图 6A),钾积累量增加15.3% ~ 28.5%(图 6B);高钾条件下增幅更大,地上部生物量增加14.9% ~ 20.0%(图 5B),钾含量增加10.6% ~ 23.5%(图 6A),钾积累量增加40.1% ~ 52.4%(图 6B)。过表达ZmK2.1拟南芥只在供钾充足条件下可显著促进植株生长和钾素利用的特征,可能与Su等[32]报道的ZmK2.1本身是一个低亲和([K+]≥1 mmol/L时介导钾吸收)的K+通道密切相关。
进一步的研究表明,在钾充足条件下,过表达ZmK2.1拟南芥的气孔导度、光合速率及蒸腾速率较对照相比均显著增加(图 7),气孔导度增加26.5% ~ 40.2%(图 7A),光合速率增加17.5% ~ 24.3%(图 7B),蒸腾速率增加27.1% ~ 49.9%(图 7C)。这与已经报道的拟南芥气孔开放型K+通道KAT1和KAT2的特征类似[36]。这一现象表明过表达ZmK2.1基因可增加叶片保卫细胞的钾浓度,进而增加细胞膨压,细胞吸水导致气孔更高效地开放,因而其气孔导度增加,促进植株对CO2的摄取,促进光合效率,从而促进植株生长。另一方面,气孔导度增加也增强了植株的蒸腾速率,促进矿质元素随质流从根系向地上部转运,因而植株地上部的钾含量及钾积累量得到同步增加。
4 结论通过分子生物学操作,在模式植物拟南芥中过表达玉米气孔保卫细胞开放型K+吸收通道ZmK2.1,在钾充足(1 mmol/L K+和10 mmol/L K+)条件下可显著提高植株的气孔导度,增加植株的光合速率及蒸腾速率,进而促进植株生长,提高植株的钾素利用能力。这一研究从基因工程角度,为进一步提高植物的钾素利用效率提供了有力的技术支撑。
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2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China