2022, Vol. 54
畜牧业迅速发展的同时伴随着大量畜禽粪污产生，我国畜禽养殖粪污年产生总量约为38亿吨，综合利用率为75%[1]。作为有机肥进行还田是畜禽粪便资源化利用的最主要方式之一[2]。有机肥本身含有大量有机质及多种营养成分，施入土壤可提高土壤养分，陈洁等人[3]研究得出长期施用有机肥可显著增加土壤碳氮库，并增加土壤有效磷、速效钾等养分含量。土壤酶活性也是评价土壤肥力指标之一[4]，多种酶与土壤元素转化密不可分，如蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶参与碳、氮、磷等化学循环。长期施用有机肥会显著提高土壤酶活性，而施用化肥对酶活性的影响不大[5]。研究土壤酶对粪肥添加的响应有利于明确土壤养分转化机制，增加土壤肥力。
土壤微生物是土壤中物质转化的动力，如固氮作用、硝化作用、反硝化作用、腐殖质的分解和合成等过程[6]。因此土壤微生物种类和数量及群落结构也能反映土壤质量状况[7]。施肥会改变土壤微生物组成及群落多样性，研究表明施用有机肥提高土壤变形菌门和厚壁菌门的相对丰度，并降低放线菌门相对丰度[8]。长期施用粪肥会降低土壤真菌与细菌比，显著改变土壤细菌和真菌群落的结构[9]。另外有研究表明，pH、全氮、全磷和铅含量是影响土壤微生物群落结构的主要环境因子，不同粪肥添加改变了稻田土壤理化性质，从而间接改变了稻田土壤微生物的群落组成[10]。施入粪肥有利于提高土壤微生物数量及群落多样性[11-12]，而长期施入化肥会使土壤养分种类单一化，并且会使土壤pH降低，导致土壤微生物数量和种类减少。因此，研究粪肥还田后的微生物群落结构变化对土壤质量管理具有重要作用。
不同类型畜禽粪便由于成分和性质的差异，在不同地区、不同种植方式下施用后对作物生长、土壤养分及微生物性状等的影响也存在较大差异[13-14]，李祥云等[15]将鸡粪、猪粪和牛粪施用于菜地，得出施用猪粪的蔬菜营养成分较均衡，建议在蔬菜有机栽培生产上广泛应用。张永峰等[16]研究显示不同粪肥均能够明显提高玉米产量和土壤肥力，施用鸡粪效果最好。陈贵等[17]在稻田上的试验表明猪粪更能提高土壤养分含量。本研究选择内蒙古农牧交错地区青贮玉米为研究对象，通过田间试验比较牛粪、羊粪、猪粪3种当地主要粪肥施用后对土壤养分和酶活性的影响，并明确土壤微生物对不同粪肥响应特征，以便综合评价不同类型粪肥还田后对土壤作用效果，对于指导当地粪肥还田、促进资源有效利用具有指导意义。
1 材料与方法 1.1 试验地概况试验于2020年进行，试验地点位于内蒙古乌兰察布市察哈尔右翼前旗，气候属于北温带大陆性干旱气候，冬季长达5个月，年平均气温4.5 ℃，年降水量376.1 mm，多集中在7—8月上旬。该地区土壤属于半干旱草原栗钙土地带中的暗栗钙土带。试验前耕层土壤(0 ~ 20 cm)基本理化性质如表 1所示。
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表 1 试验地土壤基础理化性质 Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil |
选用羊粪、牛粪、猪粪3种农牧交错区典型畜禽粪污，粪肥具体养分含量如表 2所示。研究在等氮量条件下，施用粪肥对作物和土壤的影响。试验共设置4个处理(表 3)，每个处理重复3次，粪肥经过自然堆肥发酵后施入土壤，各处理施肥量根据当地农民的施肥习惯设置。化肥种类为复合肥，粪肥的磷钾施用量根据等氮量条件和磷钾养分含量换算得到。每个小区面积为500 m2。供试青贮玉米品种为京科9685，播种日期为2020年5月6日。
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表 2 供试肥料的养分含量 Table 2 Nutrient contents of manures applied |
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表 3 试验设计及施肥方案 Table 3 Test design and fertilization scheme |
在青贮玉米成熟期采集0 ~ 20 cm土壤样品，各小区分别采取10个样品混匀，所有土壤样本带回实验室，分成两部分，一部分鲜土过10目筛后，用于测定铵态氮、硝态氮、微生物生物量碳氮和含水量，部分鲜样取回后保存在–80 ℃冰箱用于测定微生物群落结构；另一部分土样风干过20目筛后用于土壤理化性质测定。
1.4 试验测定方法 1.4.1 土壤理化性质测定土壤有机质采用重铬酸钾容量法–外加热法测定；全氮采用全自动凯氏定氮法测定；铵态氮、硝态氮采用0.01 mol/L CaCl2浸提，流动分析仪(AA3)测定；全磷采用NaOH熔融–钼锑抗比色法测定；全钾采用NaOH熔融–火焰光度法测定；有效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提–钼锑抗比色法测定；速效钾采用醋酸铵浸提–火焰光度法测定；pH采用5︰1水土比(V︰m)pH计测定。
1.4.2 土壤酶活性及微生物测定土壤酶活性参考关松荫[18]的方法进行测定，脲酶采用苯酚钠–次氯酸钠比色法测定，用单位时间和单位干土中产生的NH4+-N的质量表示；土壤蔗糖酶采用3, 5–二硝基水杨酸比色法测定，用单位时间和单位干土中产生葡萄糖的质量表示；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定，用滴定相当于1 g干土滤液所消耗的0.02 mol/L KMnO4体积表示；碱性磷酸酶采用苏州科铭生物技术公司的碱性磷酸酶试剂盒测定；土壤微生物生物量碳氮采用熏蒸–浸提法测定[19]。
采用Fast DNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)试剂盒提取土壤DNA，使用NanoDrop2000紫外–可见分光光度计进行DNA浓度和纯度测定，采用1% 琼脂糖凝胶电泳对DNA完整性进行检测。微生物群落结构采用16S rRNA测序技术，引物设计338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTA CHVGGGTWTCTAAT)。2% 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用Illumina MiSeq平台对样本进行测序。生物信息分析流程使用的是QIIME2推荐的DADA2方法对所有样品的全部原始序列进行质量控制，去噪，拼接，并且去嵌合体，形成OTU[20]，本文中提到OTU应被称为扩增特征序列(Amplicon Sequence Variant)，选取OTU的代表性序列，与数据库(16S默认Greengenes Database 13_8版本[按99%序列相似性聚类]进行比对获得物种注释信息。基于OTU的绝对丰度及注释信息，对每个样品在7个分类水平(界、门、纲、目、科、属、种)上的序列数目占总序列数的比例进行统计，有效地评估样本的物种注释信息。
1.5 数据处理与分析土壤理化性质部分采用Microsoft Excel 2016处理数据并作图，采用SPSS 24.0进行单因素方差分析检验和数据分析。用Duncan新复极差法比较不同处理的Alpha多样性在0.05水平下的差异显著性；运用Canoco 5.0软件做主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。微生物数据作图采用深圳微生太科技有限公司平台进行作图。
2 结果与分析 2.1 不同粪肥对土壤养分的影响不同粪肥处理对土壤养分的影响如图 1所示，不同类型粪肥对土壤养分的影响不同。CM处理的有机质含量最高，较F处理高9.7%；PM处理的全氮含量最高，较F处理高11.3%；但各处理间有机质和全氮含量差异均不显著。土壤硝态氮含量大小为PM > F > CM > GM，PM处理的土壤硝态氮含量显著高于GM和CM，且较F、GM和CM分别高23.6%、73.1% 和64.6%；各处理的土壤铵态氮含量差异不显著；PM和CM处理的有效磷含量显著高于F；不同粪肥处理速效钾的含量大小为CM > F > GM > PM，且CM处理显著高于GM和PM处理。不同处理间pH差异不显著，与F相比较，猪粪处理的土壤pH略有降低，羊粪和牛粪处理的土壤pH略有提高。
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(图中小写字母不同表示处理间差异显著(P < 0.05)，下图同) 图 1 不同施肥处理对土壤理化性质的影响 Fig. 1 Effects of different fertilization treatments on soil physiochemical properties |
不同粪肥处理对土壤微生物生物量碳氮的影响如图 2所示。不同处理土壤微生物生物量碳含量范围为133.55 ~ 177.86 mg/kg，CM处理显著高于其他处理，分别较F、GM和PM处理增加33.2%、32.0% 和31.8%。不同处理土壤微生物生物量氮含量范围为24.36 ~ 32.49 mg/kg，且各粪肥处理均大于F处理，其中CM处理显著高于其他处理，分别较F、GM和PM处理增加33.5%、21.2% 和28.7%。
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图 2 不同施肥处理对土壤微生物生物量碳氮的影响 Fig. 2 Effects of different fertilization treatments on soil microbial biomass carbon and nitrogen |
土壤蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶与土壤碳氮磷元素转换密切相关。各处理酶活性如表 4所示，不同粪肥均较F处理提高了土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性，PM处理的脲酶和碱性磷酸酶活性分别较F处理提高了30.7% 和26.8%。不同处理间蔗糖酶活性的大小为GM > PM > CM > F，GM处理蔗糖酶活性最高，分别较F、PM和CM高150.4%、31.0% 和92.0%。CM处理过氧化氢酶活性显著高于GM和F处理，分别较F、GM和PM处理高30.1%、11.8% 和7.14%。
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表 4 不同施肥处理对土壤酶活性的影响 Table 4 Effects of different fertilization treatments on soil enzyme activities |
土壤酶活性与土壤环境条件的改变密切相关，将土壤酶活性与土壤理化指标等环境因子进行相关性分析(表 5)，土壤脲酶活性与土壤有机质、全氮、有效磷含量显著正相关；蔗糖酶活性与土壤pH呈显著负相关；碱性磷酸酶活性与土壤有效磷含量呈显著正相关，与pH呈显著负相关；过氧化氢酶活性与土壤硝态氮呈显著正相关。
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表 5 土壤酶活性与土壤理化性质的相关性 Table 5 Correlations between soil enzyme activities and soil physiochemical properties |
经样本测定分析得到土壤样本测序深度合理。通过对OTU数量(图 3)和微生物多样性指数(表 6)的分析，可了解土壤微生物群落物种丰富度和多样性。4个处理共有OTU数为654，不同处理OTU数量大小为PM > CM > GM > F，其中PM处理OTU数量最多为1 122，是F处理的2.88倍；CM处理OTU为550，是F处理的1.41倍；GM处理OTU为405，是F处理的1.04倍。由表 6可以看出，CM处理Shannon指数最高，PM处理Simpson指数较低，Chao1指数大小排序为PM > CM > F > GM，猪粪和牛粪处理微生物多样性高于羊粪处理。
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图 3 OTU水平的Venn图 Fig. 3 Venn diagram at OTU level |
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表 6 不同处理土壤细菌Alpha多样性指数 Table 6 Alpha diversity indexes of soil bacteria under different treatments |
不同粪肥处理微生物群落差异性分析如图 4所示，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分别解释不同样本细菌群落总变异的38.72% 和15.31%。不同处理在PC1轴上多集中在负半轴；在PC2轴上F和PM处理主要分布在负半轴，GM和CM处理主要分布在正半轴。整体来看，PM处理和其他处理微生物群落结构差异性较大。
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图 4 不同施肥处理微生物群落主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis of microbial communities under different fertilization treatments |
由图 5可知，在细菌门水平上的优势种群有放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)，分别占土壤细菌群落的26.42% ~ 41.12%、21.41% ~ 27.69%、9.23% ~ 15.14%、8.80% ~ 11.63%、3.72% ~ 22.54%，几种优势种群共占细菌群落的85% 以上。不同处理土壤细菌门水平发生一定程度的改变，Actinobacteria相对丰度大小为CM > F > GM > PM，Proteobacteria相对丰度大小为GM > CM > F > PM，Acidobacteria相对丰度大小为F > PM > GM > CM，Chloroflexi相对丰度大小为F > PM > GM > CM，Firmicutes相对丰度大小为PM > CM > GM > F。PM处理的Firmicutes相对丰度较其他处理高，而Actinobacteria和Proteobacteria的相对丰度较低。F处理的酸杆菌门Acidobacteria和Chloroflexi相对丰度较高，而Firmicutes相对丰度较低。GM和CM处理的Actinobacteria和Proteobacteria相对丰度较高，Acidobacteria相对丰度较低。
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图 5 细菌门水平上的土壤微生物物种组成 Fig. 5 Composition of soil microbial species at phylum level of bacteria |
不同处理下细菌科水平上的土壤微生物物种组成如表 7所示，放线菌科(Gaiellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、单核细菌科(Solirubrobacterales)的相对丰度较高。可以看出GM、CM和F处理的微生物物种组成较为相似，PM处理与其他处理的微生物物种组成不同。PM处理梭菌科(Clostridiaceae)较其他处理相对丰度较高，放线菌科(Gaiellaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)相对丰度较低。
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表 7 细菌科水平上的土壤微生物物种组成(%) Table 7 Composition of soil microbial species at family level of bacteria |
图 6是施用不同粪肥后土壤环境因子对土壤微生物菌群的影响，通过RDA分析，估测各种环境因子对土壤微生物门水平菌群的影响。土壤环境因子包括有机质、全氮、全磷、全钾、铵态氮、硝态氮、有效磷、速效钾、pH。如图所示，第一主成分和第二主成分的解释率分别为49.97% 和12.49%，pH、有效磷和铵态氮对门水平微生物菌群的影响作用最大，是影响土壤细菌群落的关键环境因子。
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图 6 门水平微生物物种与环境因子之间RDA分析 Fig. 6 RDA analysis between microbial species at phylum level and environmental factors |
图 7是施用不同粪肥后土壤环境因子对土壤微生物门水平菌群的影响，结果显示，NKB19、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、TM6相对丰度与土壤碱性磷酸酶活性呈显著正相关。GAL15相对丰度与土壤全氮、有机质含量显著负相关。酸杆菌门(Acidobacteria)、WS3相对丰度与NH4+-N含量呈显著负相关。芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和OD1相对丰度与NH4+-N含量呈显著正相关。NKB19和蓝细菌门(Cyanobacteria)与有效磷量呈显著正相关。TM6和BRC1与pH呈显著负相关。厚壁菌门(Firmicutes)与速效钾和脲酶呈显著正相关。OP3与脲酶呈显著负相关。OP3、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)与过氧化氢酶呈显著负相关。衣原体门(Chlamydiae)与蔗糖酶呈显著负相关。
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(SOM：有机质；TN：全氮；TK：全钾；AP：有效磷；NH4+-N：铵态氮；Invertase：蔗糖酶；Urease：脲酶；Catalase：过氧化氢酶；ALP：碱性磷酸酶。*表示0.01≤ P < 0.05，** 表示0.001≤P < 0.01) 图 7 不同施肥处理细菌门水平下物种丰度与土壤理化性质和酶活性的相关性 Fig. 7 Correlations of bacterial species abundance at phylum levels with soil physicochemical properties and enzyme activities under different fertilization treatments |
大量研究表明施用有机肥显著影响土壤养分含量[21-22]，本研究和前人研究一致，施用粪肥能够增加土壤养分含量，并且不同粪肥对土壤养分影响不同。不同处理土壤有机质和全氮差异性不显著，但是施用牛粪处理的土壤有机质和全氮含量略高，这主要是与牛粪本身有机质含量较高以及牛粪中氮的矿化率较高有关[23]。猪粪处理有效磷含量高于其他处理，这与猪粪自身有效磷含量较高有关。土壤酶活性受土壤理化性质影响，脲酶活性与土壤有机质、全氮和有效磷含量显著正相关，碱性磷酸酶活性与有效磷含量显著正相关，因此牛粪和猪粪处理脲酶活性较高，且猪粪处理的碱性磷酸酶活性较高。化肥提高土壤中NO3–-N含量，容易造成较大的NO3–-N淋失风险。有研究表明与施用化肥比较，长期适量施用粪肥不会造成NO3–-N淋失风险，粪肥处理中土壤微生物显著提高了对胺类、碳水化合物类碳源的利用能力，降低无机氮淋失风险[24]。但是不同粪肥之间，猪粪更容易造成NO3–-N淋失量增加[25]，这可能是因为在增施氮肥的同时，高C/N的有机肥对于降低土壤中NO3–-N含量的效果更好，而猪粪的C/N较小[26]。另外，不同粪肥间牛粪处理微生物生物量碳氮含量较高，这可能是因为不同粪肥的C/N会影响土壤微生物生物量碳氮，有机肥的C/N为15︰1左右时，氮活性较高。而过高的C/N会使土壤氮素活性大幅度降低，氮素供应不足，不利于土壤微生物生长，使土壤微生物生物量碳氮较低[8、27]，3种粪肥中牛粪的C/N较接近于15，这可能是牛粪处理的微生物生物量碳氮含量较高原因之一。
大量研究表明有机肥较化肥更能增加土壤微生物群落多样性[28-29]，但是对于不同粪肥的对比研究较少，本研究表明与牛粪和羊粪相比，猪粪在提高土壤微生物物种丰富度及群落多样性方面效果较好，这与理鹏等[10]在稻田中施入不同粪肥对土壤微生物群落多样性的研究结果一致。本研究在北方旱地施用不同类型粪肥，列出在微生物细菌门水平上7个处理前20个细菌门，其中优势种群有放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)，这与之前的研究结果一致[30-31]。微生物科水平上放线菌科(Gaiellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、单核细菌科(Solirubrobacterales)的相对丰度较高。NH4+-N、pH、有效磷和土壤酶影响大多微生物群落结构。不同粪肥处理之间，猪粪处理厚壁菌门和梭菌科的相对丰度最高，梭菌科属于厚壁菌门，这可能是由于厚壁菌门与土壤脲酶活性呈显著正相关关系，猪粪处理脲酶活性较高导致厚壁菌门丰度较高。厚壁菌可以产生芽孢，芽孢杆菌属于厚壁菌门，研究表明芽孢杆菌产生孢子，可以抵抗干燥脱水和极端环境。所以施用粪肥可以有助于土壤中植物的抗逆性[32]。放线菌门与NH4+-N含量呈显著负相关，而猪粪处理NH4+-N含量较高可能导致猪粪处理降低了土壤放线菌门和放线菌科的相对丰度，研究表明放线菌门参与固氮、有机质循环，促进土壤中动植物残体降解[32]，土壤中放线菌门相对丰度降低有利于土壤有机质的累积[33]。猪粪处理的硝化螺旋菌门相对丰度较其他处理低，硝化螺旋菌门具有完整的反硝化以及固定CO2的代谢通路，参与土壤多种元素的地球化学循环过程[34]。羊粪和牛粪处理的变形菌门相对丰度较高，变形菌门包括很多可以进行固氮的细菌，参与土壤养分的生物循环[29]。酸杆菌门与土壤NH4+-N含量呈显著负相关关系，化肥处理较低的NH4+-N含量可能导致酸杆菌门相对丰度较高，而酸杆菌门降解土壤植物残体，促进光合作用和土壤物质循环[35]。
4 结论1) 粪肥较化肥提高土壤有机质、全氮、NH4+-N和有效磷含量。其中牛粪处理显著提高土壤速效钾含量，猪粪处理显著提高土壤NO3–-N含量。不同施肥处理对于土壤pH影响不显著，但猪粪处理的pH略有降低，羊粪和牛粪处理的土壤pH略有提高。
2) 牛粪较化肥处理显著提高土壤微生物生物量碳氮和过氧化氢酶活性，猪粪处理显著提高土壤脲酶和碱性磷酸酶活性，羊粪处理显著提高了蔗糖酶活性。
3) 猪粪处理的土壤厚壁菌门相对丰度较高，牛粪和羊粪处理的放线菌门和变形菌门相对丰度较高，化肥处理的酸杆菌门和绿弯菌门相对丰度较高。土壤pH、有效磷、NH4+-N是影响土壤微生物菌群结构的主要环境因子，而短期内施用不同粪肥对土壤微生物群落多样性的影响差异不显著。
4) 不同粪肥在提高土壤养分、土壤酶活性及微生物群落多样性方面均具有显著的积极作用，且不同粪肥对土壤酶活性及微生物群落组成的影响不同，在北方农牧区施肥时应结合田块相关指标丰缺状况，选择更为互补的粪肥进行施肥，以便更好地培肥土壤。
致谢: 感谢内蒙古乌兰察布市农业技术推广站魏静给予的帮助。
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