2022, Vol. 54
硒(Se)是一种人体健康所必需微量元素，缺硒会引发克山病、大骨节病、心肌变性、肌营养不良、白内障等多种疾病[1]。全球性的缺硒现象较为普遍，据统计，我国约72% 的国土面积，以及将近2/3的居民因膳食结构中硒含量不足，处于缺硒或临界缺硒的边缘[2-3]，究其根本原因可能是由土壤硒的有效性低从而引起的人体植食性硒摄入缺乏所导致[4]。因此，可以通过粮食作物的农艺生物强化措施来提高人体的硒营养水平。而水稻是我国第一大粮食作物，不仅能提供人体所需80% 左右的能量[5]，还能供给日常所需的大部分的蛋白质和微量元素[6]。因此，富硒水稻生产是我国目前应用最广泛和最有效的补硒途径。
虽然水稻在人体摄取硒的方面具有重要作用，但是全球范围内大米的硒含量普遍较低。调查表明我国市售的160种大米中硒含量的变化范围约为0.003 ~ 0.049 mg/kg，均值为0.026 mg/kg[7-8]，并且富硒品种和非富硒品种之间的差异显著[9]，即使是在富硒品种的种植过程中也需要额外再施用富硒肥料来维持籽粒高硒含量的性状表达[10]。通常情况下，叶面喷施的富硒效果优于土壤基施[11]。叶面喷施硒肥的主要形态为硒酸钠或亚硒酸钠，且两者富硒效果的高低规律尚未达成统一定论，还需更深入的研究来证实。除了硒酸钠和亚硒酸钠外，硒代蛋氨酸或化学纳米硒等其他形态硒肥的效果还鲜有报道。前期的研究结果表明小麦和玉米喷施硒代蛋氨酸时，其生物有效性低于亚硒酸钠和硒酸钠[12]。由于水稻和小麦、玉米的生长环境和作物品种差异较大，所以在之前研究的基础上，通过大田试验研究了水稻喷施不同形态的硒肥对水稻籽粒富集硒的特征，并且根据不同的施肥用量与籽粒硒含量的相关性来估算最佳施肥用量，旨在为富硒大米的开发提供科学的理论依据和技术支撑。
1 材料与方法 1.1 研究区概况水稻田间试验位于黑龙江省农科院田间试验基地(哈尔滨市方正县德善镇，128°83′E、45°83′N)，属于寒温带大陆性季风气候，年均降水量579.7 mm，年均日照时数4 446 h。试验点的表层土壤(0 ~ 20 cm)基本理化性质如表 1所示。表层土壤的硒含量为0.20 mg/kg，根据硒元素生态景观的界限值划分[13]，试验点土壤属于足硒土壤(0.175 ~ 0.450 mg/kg)。本试验供试水稻品种为稻花香2号，为北方种植的粳稻品种之一。水稻种子由黑龙江省农科院土壤肥料与环境资源研究所提供。
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Properties of tested soil |
试验一于5月播种水稻，同年9月收获。在水稻种植过程中，通过叶面喷施不同形态的硒肥来增加水稻籽粒的硒含量。富硒叶面肥在水稻扬花期(7月)一次喷施，喷施量分别为15 g/hm2(以Se计)。试验共包括5个处理：空白(水，CK)、亚硒酸钠(Se(Ⅳ))、硒酸钠(Se(Ⅵ))、硒代蛋氨酸(SeMet)和化学纳米硒(nano-Se)，每个处理3个重复，共15个试验小区。小区随机排列，面积为5 m × 5 m，各小区之间设有1 m的缓冲带。试验中所使用的硒试剂均为分析纯试剂，先溶解于去离子水中配成硒肥母液，再加自来水稀释(400 L/hm2)，用电动喷雾器进行叶面喷施。硒酸钠和亚硒酸钠购于Sigma公司(St Louis, MO, USA)，硒代蛋氨酸由山西大学提供。化学纳米硒参照Lin和Wang[14]的方法制备。化学纳米硒的粒径由透射电子显微镜(TEM-EDAX, Hitachi HT7700, Japan)测定，其颗粒大小为(142.8 ± 9.1) nm。
1.2.2 叶面硒肥的施用量对水稻硒含量的影响及其相关性试验二设置3个硒施用量(0、15和30 g/hm2，以Se计)和2个施用方式(亚硒酸钠单施、腐殖酸+亚硒酸钠复合施用，记作Se(Ⅳ)和HA+Se (Ⅳ))，共5个处理，每个处理3个重复，共15个小区。每个小区随机排列，面积为5 m × 5 m，小区之间设有1 m的缓冲带。试验中亚硒酸钠购于Sigma公司(St Louis, MO, USA)，腐殖酸由中项国际有限公司提供，腐殖酸用量为1.5 L/hm2。田间作物的管理和硒肥施用方法与试验一相同。
1.3 样品制备与测定水稻成熟后每个小区分别收取1 m2水稻稻谷样品，晒干后用脱粒机去除颍壳，称重计算每平方米籽粒和颍壳的产量并换算为t/hm2。采取S型五点采样法采集各个小区的籽粒、秸秆和颍壳样品，充分混匀备用。植物样品用自来水清洗3遍，去离子水清洗3次，在105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干，粉碎并过0.5 mm尼龙网筛。土壤样品风干，剔除样品中植物根系，研钵研磨过0.15 mm尼龙网筛，样品存放于自封袋中待测。
称取0.250 0 ~ 0.251 0 g植物或土壤样品，分别通过硝酸或王水(HCl: HNO3=3︰1)浸泡过夜，微波消解(美国CEM公司，MARS5)。消解液加6 mol/L盐酸后，经100 ℃水浴2 h将六价硒还原为四价硒[15]，使用双道原子荧光光度计(北京吉天，AFS-920)测定溶液中的硒含量。样品消解及水浴过程中使用的各种酸均为优级纯，分析过程加入空白及国家标准物质(GBW10014和GBW07410)进行分析质量控制，分析过程中硒的回收率达到85% ~ 110%。测定过程中使用的硒标准贮备液(100 mg/L)购于国家环保总局标准样品研究所。
1.4 数据处理相关指标计算公式如下(均以干物质量(DW)计)：
| $ \begin{array}{l} \ \ \ \ \ {\rm{籽粒中硒的总量}}({\rm{g}}/{\rm{hm}}^2)={\rm{籽粒硒含量}}({\rm{mg}}/{\rm{kg}})\times {\rm{籽}}\\ {\rm{粒产量}}({\rm{kg}}/{\rm{hm}}^2)/1 \ 000 \end{array}$ | (1) |
| $\begin{array}{l}\ \ \ \ \ {\rm{颍壳中硒的总量}}({\rm{g}}/{\rm{hm}}^2)={\rm{颍壳硒含量}}({\rm{mg}}/{\rm{kg}})\times {\rm{颍}}\\ {\rm{壳产量}}({\rm{kg}}/{\rm{hm}}^2)/1\ 000 \end{array} $ | (2) |
| $\begin{array}{l}\ \ \ \ \ {\rm{籽粒硒的回收率}}(\%)={\rm{籽粒中硒的总量}}/15 \\ ({\rm{g}}/{\rm{hm}}^2)\times 100 \end{array} $ | (3) |
| $\begin{array}{l}\ \ \ \ \ {\rm{颍壳硒的回收率}}(\%)={\rm{颍壳中硒的总量}}\\ /15({\rm{g}}/{\rm{hm}}^2)\times 100 \end{array} $ | (4) |
| $\begin{array}{l}\ \ \ \ \ {\rm{转移系数}}({\rm{TF}})={\rm{籽粒中硒含量}}({\rm{mg}}/{\rm{kg}})/{\rm{秸秆中硒}}\\ {\rm{含量}}({\rm{mg}}/{\rm{kg}}) \end{array} $ | (5) |
试验数据表示为3次重复的平均值和标准误差，采用SAS软件进行方差分析(多重比较采用Duncan法)，图采用Sigmaplot 12.5软件绘制。
2 结果与分析 2.1 不同形态叶面硒肥对水稻硒含量的影响图 1是试验一中不同形态硒处理对水稻地上部硒含量的影响。根据黑龙江省富硒大米的现行地方标准(DB23T 790—2004)中规定，富硒稻谷中硒含量范围为0.10 ~ 0.30 mg/kg[16]。但是，CK处理中的籽粒硒含量较低，仅为0.08 mg/kg，尚未达到富硒大米的含量要求(图 1A)。当对水稻叶面喷施15 g/hm2的硒肥后，籽粒的硒含量增加了0.06 ~ 0.64 mg/kg，相当于每克硒施用到每公顷农田中将增加0.004 ~ 0.043 mg/kg的籽粒硒含量。不同形态的硒肥处理水稻籽粒的硒含量差异显著(P < 0.05)，SeMet处理水稻籽粒的硒含量最高，nano-Se处理的籽粒硒含量最低，前者的硒含量比后者高出4.03倍。而Se(Ⅳ) 和Se(Ⅵ) 两个处理下的水稻籽粒的硒含量无显著性差异。
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(A. 籽粒，B，颍壳，C. 秸秆；数据表示为均值±标准误差(n=3)；图中小写字母不同表示处理间差异显著(P < 0.05)，下图同) 图 1 不同形态叶面硒肥处理下水稻各部位的硒含量 Fig. 1 Se contents in different rice parts treated with different forms of foliar Se fertilizers |
叶面喷施不同形态硒肥显著提高水稻颍壳和秸秆的硒含量(图 1B、1C)。与CK相比，喷施硒肥处理颍壳和秸秆中的硒含量分别显著提高3.04倍~ 6.92倍和2.03倍~ 4.70倍(P < 0.05)。SeMet处理的颍壳和秸秆硒含量最高，分别比其他喷硒处理高76.4% ~ 96.1% 和14.1% ~ 87.9%。同时，不同形态的硒肥处理，水稻籽粒、颍壳和秸秆硒含量的高低顺序也不同。在SeMet和Se(Ⅵ)处理下，水稻各部位硒含量的先后顺序为：颍壳 > 秸秆 > 籽粒；然而，在Se(Ⅳ) 和nano-Se处理下，水稻各部位硒含量的先后顺序为：秸秆 > 颍壳 > 籽粒。
2.2 不同形态叶面硒肥对水稻产量、硒回收率和转移系数的影响表 2为不同形态叶面硒肥对水稻产量、硒回收率和转移系数的影响。总体上，水稻籽粒和颍壳产量均值分别为6.54 t/hm2和1.44 t/hm2；叶面硒肥的施用均能增加籽粒和颍壳的产量，但增产不显著。施用不同形态的叶面硒肥，水稻籽粒和颍壳的产量分别比CK高出17.1% ~ 36.5% 和3.4% ~ 29.3%。其中，SeMet处理的籽粒产量最高，而Se(Ⅵ) 处理的颍壳产量最高。水稻籽粒和颍壳中硒的回收率是用来评价不同形态的叶面硒肥的富硒效果。结果表明，不同形态的硒肥能显著影响水稻籽粒和颍壳中硒的回收率(P < 0.05)。SeMet处理籽粒的硒回收率最高；而Se(Ⅵ) 和Se(Ⅳ) 处理的硒回收率次之，且两处理间差异不显著；nano-Se处理籽粒的硒回收率最低，且比其他处理低56.1% ~ 80.9%。同样，SeMet处理颖壳硒回收率最高且各处理的先后顺序为：SeMet > Se(Ⅵ) > nano-Se > Se(Ⅳ)。
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表 2 不同形态叶面硒肥对水稻产量、硒回收率和转移系数的影响 Table 2 Rice yields, Se recoveries and transfer factors under different forms of foliar Se fertilizers |
转移系数是指籽粒中某元素的含量与秸秆中含量的比值，用来评价植物从秸秆向籽粒运输和富集该元素的能力。转移系数越大，则从秸秆向籽粒的转运能力越强。不同形态的硒肥处理能显著影响硒元素在水稻体内的转移系数(表 2，P < 0.05)。在SeMet处理下，硒在水稻体内的转移系数最高；而在nano-Se处理下，硒在水稻中的转移系数最低；前者的转移系数比后者高3.11倍。此外，秸秆的产量是通过水稻的秸秆籽粒比即草谷比换算得出，根据苑亚茹[17]对57个样本分析得到水稻的草谷比均值为1.01。所以，在此基础上估算得出水稻秸秆的产量均值为6.71 t/hm2(数据未列出)。根据水稻地上各部位的产量和硒含量可以计算得出，nano-Se处理下的水稻籽粒、颍壳、秸秆中的硒总量分别占地上部硒总量的13.7%、11.2% 和75.1%；而在其他处理下水稻籽粒、颍壳、秸秆中的硒总量分别占地上部硒总量的29.5% ~ 38.6%、9.0% ~ 12.7% 和50.3% ~ 60.3%(图 1，表 2)。
2.3 硒肥施用量对水稻硒含量的影响及其相关性图 2结果表明不同硒肥施用量显著影响水稻籽粒、颍壳和秸秆中的硒含量(P < 0.05)，亚硒酸钠肥料的施用方式(单施或复合施用)对籽粒、颍壳和秸秆中硒含量无显著性影响，且两个因素之间无交互作用。随着施肥量的增加，水稻籽粒、颍壳和秸秆的硒含量随之增加。除施肥量30 g/hm2下HA+Se(Ⅳ) 处理颖壳硒含量低于Se(Ⅳ) 处理外，其他施肥量下HA+Se(Ⅳ)处理的籽粒、颍壳和秸秆硒含量均高于Se(Ⅳ) 处理。根据黑龙江省富硒大米的地方标准(DB23T 790—2004)规定的一等大米的硒含量范围为0.20 ~ 0.30 mg/kg，进行水稻籽粒硒含量和硒肥施用量之间的相关性分析(图 3)。结果表明，硒肥用量和水稻籽粒硒含量符合一元线性相关关系。若叶面单施Se(Ⅳ) 使水稻籽粒的硒含量介于0.20 ~ 0.30 mg/kg，则需要Se(Ⅳ)的施用量为6.01 ~ 10.62 g/hm2；而喷施HA+Se(Ⅳ)复合肥时，需要的HA+Se(Ⅳ)复合肥的施用量为4.26 ~ 8.63 g/hm2。后者比前者的施用量约少2 g/hm2左右。此外，施用15 g/hm2和30 g/hm2 HA+Se(Ⅳ)复合肥时，水稻籽粒产量比相同施用量的Se(Ⅳ)单施的产量高出13.7%(数据未列出)。因此，上述结果表明富硒大米的生物强化过程中，与Se(Ⅳ)单施相比较，HA+Se(Ⅳ) 复合施用能增加籽粒产量并且减少硒肥的施用量。
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图 2 亚硒酸钠和腐植酸+亚硒酸钠处理下水稻各部位的硒含量 Fig. 2 Se contents in different rice parts treated with Se (Ⅳ) and HA+Se (Ⅳ) |
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(A. 亚硒酸钠；B. 腐植酸+亚硒酸钠；*、**分别表示相关性达P < 0.05和P < 0.01显著水平) 图 3 水稻籽粒硒含量和硒肥施用量之间的相关性 Fig. 3 Correlations between Se content in rice grains and application dosage of Se fertilizers |
不同形态的叶面硒肥能显著影响水稻籽粒中硒含量和回收率(图 1A，表 2)。本研究中，在SeMet处理下，水稻籽粒的硒含量和回收率显著高于其他处理，表明SeMet的生物有效性较强；但是Wang等[12]对小麦和玉米叶面喷施SeMet时，其籽粒的硒含量和回收率与Se(Ⅳ) 处理的结果相近。上述结果不一致的原因可能是由于作物叶片的延展面积不同，对叶面肥料的吸收承载力也不同，小部分的硒肥可能会残留在土壤表层而被土壤所固定。水稻生长在淹水条件下，喷施硒肥而残留在土壤中的SeMet可能会溶解在水田中而再次被根系吸收利用，所以生物有效性较高。相反，nano-Se处理下水稻籽粒的硒含量和回收率均最低(图 1A，表 2)，表明nano-Se的富硒效果和转移效率低于其他处理。这一结果可能是由秸秆对nano-Se的吸附、固定作用所导致。前人研究报道指出纳米颗粒只有穿过植物细胞壁后才能转移到细胞的原生质体中[18]，而且细胞壁的最大孔隙直径约为5 nm[19]。由此推断出小于5 nm的纳米直径颗粒才能穿过细胞壁被植物吸收利用。由于本研究所用化学纳米硒的粒径远大于细胞壁孔，所以推测其为导致较少量的硒被转移至籽粒中的主要原因。此外，即使在同样的硒肥形态处理条件下，不同水稻品种之间的富硒效率存在显著差异。例如，本研究表明Se(Ⅳ) 和Se(Ⅵ) 处理的籽粒硒含量和回收率的结果相近，而Deng等[20]的研究结果表明Se(Ⅵ)处理(叶面喷施)的水稻籽粒硒含量比Se(Ⅳ)处理的硒含量高35.9%。同样，本研究中，对稻花香2号水稻喷施15 g/hm2的Se(Ⅵ) 后，每克硒施用到每公顷农田中将增加0.016 mg/kg的籽粒硒含量(图 1A)；而前人的研究在对特优59水稻品种喷施20 g/hm2的Se(Ⅵ)时，每克硒施用到每公顷农田中将增加0.028 mg/kg的籽粒硒含量[21]，前者比后者的富硒效率低35.7%。
不同形态的叶面硒肥显著影响了水稻颍壳和秸秆的硒含量和分配比例(图 1B、1C)。SeMet处理下颍壳和秸秆的硒含量最高，nano-Se处理次之，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)最低且两处理间无显著差异。各处理下硒在水稻中的分配比例的高低顺序为：秸秆 > 籽粒 > 颍壳(图 1和表 2)。同样在晏娟等[22]研究中也发现水稻叶面喷施硒肥后，硒的分配比例高低为：稻草 > 稻谷。此外，不同叶面硒肥形态还能显著影响硒的转移系数(表 2，P < 0.05)。在SeMet处理下，硒在水稻体内的转移系数比纳米硒高出3.11倍(表 2)，表明纳米硒在水稻秸秆向籽粒转移的能力较弱，生物有效性较低，推测可能是由于纳米硒进入水稻体内后大部分与体内的酶或蛋白发生反应形成含硒多糖和硒蛋白等有机硒，被镶嵌在秸秆内参与水稻的生理作用，但还需要硒的形态分析和同位素标记联用技术进行深入探究。
大量研究表明，在适宜的时间施用适量的硒肥能显著增加水稻籽粒的产量。池忠志等[23]的研究结果表明，在水稻齐穗之后6 ~ 12 d时叶面喷施硒肥，水稻的增产效果最佳，随着喷施时期的延后，增产幅度会逐渐降低。田间叶面喷施15 g/hm2硒肥的水稻产量最高，而较高的硒肥用量可能会影响水稻的生长[24]。本研究表明，虽然在水稻扬花期硒肥的施用不能显著增加籽粒和颍壳的产量，但是硒肥处理下籽粒和颍壳的产量分别比空白对照处理高出17.1% ~ 36.5% 和3.4% ~ 29.3%(表 2)，表明在水稻扬花期施用硒肥有一定的增产效果。迟凤琴等[25]通过比较不同时期喷施硒肥对水稻产量的影响，也发现在扬花期喷施硒肥的增产效果明显。此外，在同等的施肥量下，HA+Se(Ⅳ) 处理的籽粒产量比Se(Ⅳ) 处理高出13.7%，表明腐殖酸与亚硒酸盐复合施用能增加水稻籽粒的产量。这一结果产生可能是因为腐殖酸参与植物体内的氧化还原过程，促进植物的呼吸作用，进而促进植物的生长[26]。
本研究表明水稻籽粒的硒含量与硒肥用量呈线性正相关关系(图 3)。在一定施肥量范围内，稻谷的硒含量随着亚硒酸盐施用量的增大而增加，但施肥量增加到一定程度后，如果继续增加施用量，稻谷的硒含量将不再增加[27]。在本研究中最大施肥量(30 g/hm2)时，水稻籽粒的硒含量尚未达到最高值(图 3A)。同样，在玉米上喷施亚硒酸盐时，玉米籽粒的硒含量也与硒肥用量呈一元线性相关关系，当每克硒施用到每公顷农田中将增加0.008 mg/kg的籽粒硒含量[28]，其籽粒硒含量的增长速度仅为水稻的一半左右(图 1A)，表明水稻对叶面硒肥的响应要优于玉米。另外，HA+Se(Ⅳ)处理的籽粒硒含量高于Se(Ⅳ) 处理(图 2A)，表明腐植酸与Se(Ⅳ)复合施用的富硒效果高于Se(Ⅳ)单施。不施肥时水稻籽粒的硒含量为0.08 mg/kg，尚未达到黑龙江省富硒大米的硒含量要求(0.10 ~ 0.30 mg/kg)，加之叶面硒肥施用后的残留效应较低[12]，因此，需要每年施用硒肥来维持富硒大米的硒含量水平。如果叶面喷施Se(Ⅳ)使水稻籽粒达到黑龙江省一等富硒大米的硒含量范围(0.20 ~ 0.30 mg/kg)，那么需要Se(Ⅳ)的施用量比喷施HA+Se(Ⅳ)复合肥多出2 g/hm2左右。由于腐殖酸中含有多种活性的官能团，如羧基、醇羟、基酚羟基等，能与人体所需的元素络合形成稳定的络合物[29]，叶面喷施之后可能不易被微生物分解或挥发损失至大气中，所以HA+Se(Ⅳ)复合施用能增加籽粒产量、减少硒肥的施用量，更环保、经济、高效。
4 结论1) 叶面喷施硒肥能提高水稻籽粒和颍壳的产量，但是增产效果不显著。除了nano-Se处理的籽粒硒含量外，叶面喷施硒肥能显著提高水稻地上各部位的硒含量水平。
2) 不同硒形态能显著影响水稻地上各部位的硒含量、硒回收率和转移系数。综合对比得出，不同形态叶面硒肥的富硒效果和转移系数的先后顺序为SeMet > Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ) > nano-Se。
3) 水稻地上部的硒含量与硒肥用量呈线性相关关系，HA+Se(Ⅳ)复合肥施用量为4.26 ~ 8.63 g/hm2时，可以使水稻籽粒的硒含量达到0.20 ~ 0.30 mg/kg，比Se(Ⅳ)单施更环保、经济、高效。
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