2. 安徽大学资源与环境工程学院, 合肥 230039;
3. 牡丹江师范学院生命科学与技术学院, 黑龙江牡丹江 157000
水稻是我国播种面积最大的粮食作物。据国家统计局数据显示,2020年我国水稻播种面积为3 006.67万hm2,比上年增加38.2万hm2,增长1.3%。在水稻育秧期间,当温度持续低于12℃时,将严重影响水稻秧苗质量,限制水稻在大田期间的生长发育,降低水稻产量[1]。随着气候变暖,双季稻和早稻的播种面积将持续增长,但极端低温天气的发生也愈加频繁。因此,寻求有效的外源调控措施,增强水稻育秧期间的低温抗性,对保障我国早稻安全生产有着重要意义。
乙烯是一种气体类激素,并参与调控植物响应逆境胁迫。植物体内,蛋氨酸在三磷酸腺苷(ATP)参与下生成S-腺苷蛋氨酸(SAM),而后通过1-氨基环丙烷羧酸(ACC)合成酶催化形成ACC,最后通过ACC氧化酶(ACO)催化生成乙烯。乙烯不仅在植物种子萌发、器官衰老和果实成熟脱落等生理过程中起重要作用[2],还参与调控植物响应高温胁迫[3]、水淹胁迫[4]、盐胁迫[5]、干旱胁迫[6]以及重金属胁迫[7]等非生物胁迫。然而,目前乙烯调控水稻秧苗响应低温胁迫的研究却鲜有报道。
水稻主要分为直播和移栽两种种植方式,我国以移栽为主。良好的秧苗素质是移栽后水稻秧苗迅速恢复和存活的关键。传统水稻育秧主要以营养土为主,但存在取土难、养分含量低和破坏生态环境等问题。相对于营养土,本课题组自主研制的无土基质和发酵基质具有养分含量高、稳定性强等众多优点,同时前期研究发现,该无土基质和发酵基质育成的水稻秧苗更耐冷[8]。本研究将运用营养土和这两种自制的育秧基质对早稻品种中早39进行育秧,两叶一心期时外源喷施乙烯利,然后进行为期3 d的低温胁迫,通过测定水稻秧苗的生化指标和基因表达,以阐明在不同育秧基质中乙烯调控水稻响应低温胁迫的生理和分子机制。
1 材料与方法 1.1 试验设计供试材料为籼型常规早稻“中早39”,由中国水稻研究所选育而成。本试验选用七寸秧盘进行育秧试验,育秧基质选择常规营养土、自制的无土基质和发酵基质。3种基质的基本理化性质见表 1。
将水稻种子催芽露白,每个秧盘播撒90 g种子。于2021年4月7日播种,秧盘放置于温室大棚中正常育秧至两叶一心,然后每盘分别喷施100 ml 1.5 g/L的乙烯利或等量清水,随后将秧盘放入人工气候室进行低温培养(白天15℃,晚上10℃)3 d。不同试验处理见表 2,每个试验处理3个重复。
在低温处理后,每个秧盘分别随机取20株秧苗测定株高、根长、叶龄、根数、茎基宽、百株地上干重、百株地下干重。同时取秧苗进行烘干,烘干后的样品研磨后称取0.1 g,用H2SO4-H2O2进行消煮,随后分别采用凯氏定氮法、钼锑抗比色法和火焰光度计法测定全氮、全磷和全钾含量[9]。
1.3 水稻生理指标的测定采取低温处理后的秧苗,通过液氮研磨后,在冰上进行相关生理指标的测定。其中,可溶性糖含量的测定采用BCA法[10];脯氨酸含量的测定采用茚三酮法[11];丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、脱氢抗坏血酸(DHA)、还原型抗坏血酸(AsA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均采用苏州科铭生物技术有限公司的检测试剂盒进行测定。
1.4 水稻耐冷基因表达测定水稻新鲜叶片剪下后立即用液氮进行研磨,加入TRizol后提取叶片总RNA;运用NanoDrop测定总RNA的含量以及纯度,通过琼脂糖凝胶电泳法确定提取的总RNA的完整性;然后将总RNA反转成cDNA (PrimeScript反转录试剂盒,TaKaRa,日本),运用Sybgreen (TaKaRa,日本)进行实时荧光定量PCR,所选基因的引物和内参基因引物见表 3;测定后以OsHistone作为内参基因,以低温条件下不添加乙烯利的处理组作为对照。
试验数据采用SAS9.2软件进行统计分析(单因素方差分析),均数采用Tukey法检验统计学差异。图、表中不同字母表示处理间均值在P < 0.05水平上有统计学差异。
2 结果与分析 2.1 水稻秧苗生长低温处理后,喷施乙烯利使无土基质育成秧苗的株高、叶龄和根数较其相应对照(A1)增加了11.24%、11.51% 和13.89%,发酵基质育成秧苗的株高和根数较其相应对照(B1)增加了12.44% 和31.84%,营养土育成秧苗的株高、叶龄和根数较其相应对照(C1)分别增加了9.74%、25.44% 和23.26% (表 4)。与对照相比,营养土中喷施乙烯利的秧苗的茎基宽显著增加17.18%。然而,各基质中乙烯利处理却显著降低了水稻的根系长度(表 4)。
不同基质之间育成的水稻秧苗在低温条件下同样存在差异。喷施乙烯利后,无土基质育成秧苗的叶龄比营养土育成的秧苗高12.95%,发酵基质育成秧苗的根长较营养土育成的秧苗高25.60% (表 4)。
2.2 水稻秧苗养分含量外源喷施乙烯利提高低温条件下水稻体内养分含量,其中发酵基质和营养土育成的水稻秧苗全氮含量分别较其相应对照高25.96% 和28.72%;无土基质和发酵基质育成秧苗的全磷含量分别较其对照高23.75% 和64.78%,而营养土育成秧苗的全磷含量与其对照相比没有显著差异;发酵基质育成的秧苗体内全钾含量较其对照高43.05% (表 5)。
外源喷施乙烯利后,无土基质育成的秧苗体内全磷和全钾含量较营养土育成的秧苗高38.97% 和13.31%;发酵基质育成的秧苗与营养土育成的秧苗相比,其全氮、全磷和全钾含量分别高30.89%、36.37%和50.05% (表 5)。
2.3 水稻秧苗渗透调节物质含量低温处理下喷施乙烯利显著提高无土基质和发酵基质育成秧苗体内的脯氨酸含量,分别比相应对照高13.72% 和18.03% (图 1A)。低温处理下喷施乙烯利使发酵基质和营养土育成秧苗体内的可溶性糖含量分别比相应对照高16.24% 和13.73% (图 1B)。
低温条件下,外源喷施乙烯利显著降低发酵基质和营养土育成秧苗体内的过氧化氢(H2O2)含量,分别降低了18.75% 和19.37% (图 2C)。乙烯利处理显著增加了水稻体内的还原型抗坏血酸(AsA)含量和降低了脱氢抗坏血酸(DHA)含量,从而提高了AsA/DHA比率,无土基质、发酵基质和营养土3种基质育成秧苗体内的AsA/DHA比率分别比相应对照高80.31%、48.13% 和36.79% (图 2D)。
低温处理下,无土基质和发酵基质育成秧苗体内的H2O2含量显著低于营养土育成的秧苗。喷施乙烯利后,无土基质和发酵基质育成秧苗的AsA含量和DHA含量均显著高于营养土育成的秧苗,而AsA/DHA比率则相反。
2.5 水稻秧苗抗氧化酶活性低温处理下,外源施加乙烯利使无土基质中水稻体内的POD和GST活性分别增加了51.80% 和19.04%;发酵基质中水稻体内的POD、SOD、GST、GPX和APX活性分别增加了23.51%、9.30%、30.70%、24.01%和20.80%;营养土中水稻体内的POD、SOD、GST和APX活性分别增加了92.32%、10.50%、19.60% 和44.84% (表 6)。
低温处理下,无土基质和发酵基质育成的水稻秧苗的POD、APX和GPX活性比营养土育成的水稻秧苗要显著增加9.02% ~ 40.65%;喷施乙烯利后,无土基质育成的水稻秧苗GPX活性比营养土育成的水稻秧苗要显著增加14.23%,发酵基质育成的水稻秧苗GST活性比营养土育成的水稻秧苗要显著增加44.37% (表 6)。
2.6 水稻秧苗抗寒基因表达喷施乙烯利后,水稻体内的TERF2、OsCDPK7、OsLti6A和OsCOIN基因的表达量均有不同程度的上升。无土基质育成的秧苗体内OsCOIN、OsTERF2、OsICE1、OsLti6A、COLD1和OsCDPK7基因的表达量较其对照显著提升了0.82倍、18.96倍、7.02倍、0.52倍、2.60倍和35.34倍(图 3);发酵基质育成的秧苗体内OsCOIN、TERF2、OsICE1、COLD1和OsCDPK7的表达量较其对照显著提升了0.61倍、19.05倍、6.09倍、3.87倍和178.39倍(图 3);营养土育成的秧苗体内OsCOIN、TERF2、OsLti6A、和OsCDPK7的表达量较其对照显著提升了79.31倍、13.91倍、6 087.18倍和1.32倍(图 3)。
低温条件下,乙烯利处理增加了无土基质和发酵基质育成秧苗体内的耐冷基因表达,然而显著降低了营养土育成的秧苗体内OsICE1和COLD1基因的表达量,这可能与基质种类有关(图 3C和图 3D)。
3 讨论 3.1 基质类型与水稻耐低温能力在3种基质中,无土基质除了全钾含量显著低于营养土,其他养分均显著高于营养土,而发酵基质养分含量均显著高于营养土(表 1)。本课题组前期研究发现,由无土基质和发酵基质育成的秧苗耐寒性更强[8]。本研究结果发现,低温条件处理后,无土基质和发酵基质生长的秧苗,其叶龄和体内全氮含量等均显著高于营养土育成的秧苗(表 5)。同时,无土基质和发酵基质育成的秧苗具有更低的H2O2含量,更高的抗氧化酶活性(表 6)和AsA/DHA比率(图 2)。说明与传统方式营养土育秧相比,本课题组自制的无土基质和发酵基质在低温条件下可通过加大水稻对养分的吸收和降低低温引起的过氧化损伤提高水稻秧苗的耐寒性,这与前期研究结果一致。
3.2 乙烯利提高低温下水稻秧苗素质低温胁迫主要通过减少植物叶片的栅栏组织厚度,造成植株生物量减少,从而影响植株形态建成、物质合成与积累[12]。本研究中,低温条件下水稻秧苗生长受阻,而外源施加乙烯利处理可以显著提高水稻秧苗的株高、叶龄和根数(表 4),说明在低温条件下外源施加乙烯利可以使水稻秧苗保持较好的生长。
然而,乙烯利抑制了水稻秧苗的根系伸长,这可能与乙烯的“三重反应”相关。外源乙烯引起黑暗中生长的黄化苗出现明显的形态学变化,包括根和下胚轴伸长受抑制,下胚轴横向生长加粗,顶端子叶弯曲生长加剧[13]。而在本试验中也发现,在3种基质中,低温条件下乙烯利处理的秧苗根系伸长和干物质积累都要显著低于对照,这也进一步证实,在低温条件下乙烯对于植物根的伸长生长有着严重抑制作用。
3.3 乙烯利通过提高水稻磷元素的吸收响应低温胁迫低温条件下,植物体内磷能够提高细胞结构的充水度和胶体束缚水的能力,减少细胞水分的损失并能增加原生质的黏合性和弹性,从而增加原生质对局部脱水的抵抗力;同时,磷还能维持和调节植物体内新陈代谢过程[14],使其在低温条件下仍能保持较高的合成水平,增加植物体内可溶性糖类、磷脂等浓度提高植株的抗寒、抗旱等能力。在本次试验中,乙烯利处理后显著提高水稻秧苗体内的磷含量(表 5),说明乙烯利通过促进水稻秧苗对磷的吸收提高其耐寒性。
3.4 乙烯利通过提高水稻秧苗渗透调节物质含量响应低温胁迫脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体中重要的渗透调节物质,在植物遭受低温胁迫时,植物中的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量会自动积累,达到降低冰点和防止细胞脱水的效果[15]。适宜浓度的乙烯利处理可显著提高桃树在低温条件下的脯氨酸和可溶性蛋白含量[16]。外源施加乙烯利可以通过提高日本结缕草体内脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量,调节细胞渗透势,减小低温损害[17]。在本次试验中,外源施加乙烯利处理明显提高3种基质中水稻秧苗的脯氨酸和可溶性糖含量(图 1),说明低温条件下外源施加乙烯利通过提高水稻秧苗的脯氨酸和可溶性糖含量调节水稻秧苗渗透势,从而提高水稻秧苗的抗寒性。
3.5 乙烯利通过调控水稻秧苗体内氧化还原水平提高水稻耐低温胁迫能力H2O2是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧,当植物受到逆境胁迫时,其含量急剧上升,造成植物的过氧化损伤。AsA是辅酶、自由基清除剂、电子共体/受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物,DHA是AsA的可逆的氧化型,与抗坏血酸共同组成氧化还原系统[18-19]。在本试验中,低温条件下外源施加乙烯利显著降低发酵基质和营养土育成秧苗的H2O2含量,同时提高无土基质、发酵基质和营养土3种基质育成秧苗的AsA含量和AsA/DHA比率(图 2)。说明低温条件下,乙烯利通过提高水稻秧苗的AsA含量和AsA/DHA比率降低水稻体内的H2O2含量,从而缓解低温胁迫引起的过氧化损伤。
植物遭受逆境胁迫时体内活性氧(ROS)含量上升,此时植物体内抗氧化系统对缓解逆境胁迫引起的过氧化损伤起重要作用[20]。SOD通过特异性地将O2–·歧化为H2O2和O2,随后通过CAT、POD和APX等将植物体内的过氧化物氧化为H2O等无害物质。GST是植株内的解毒酶,主要催化各种化学物质和代谢产物与GSH的巯基共价键结合,使亲水化合物变成亲水物质,从而达到将植株体内潜在或具有毒性的物质降解的效果。GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化GSH氧化的主要酶之一。GPX能够特异地催化GSH与ROS反应,生成GSSG,从而保护生物膜免受ROS的损害,维持细胞的正常功能。适宜浓度的乙烯利可以通过提高低温条件下植株体内抗氧化酶的活性来提高植物的抗寒性。比如,低温条件下,用200 mg/L乙烯利喷洒香蕉幼苗叶片,可显著提高香蕉叶片的SOD、POD和CAT活性[21]。乙烯利和硒配合使用时,显著提高低温条件下铁皮石斛体内CAT、SOD和POD活性。在本试验中,与对照相比,低温条件下进行乙烯利处理,使3种基质育成秧苗体内的POD、SOD、GST、GPX和APX五种抗氧化酶活性均有不同程度提升(表 6)。说明低温条件下,乙烯利通过提高水稻秧苗的抗氧化酶活性来减少水稻秧苗的H2O2含量,从而提高水稻秧苗在低温条件下的抗寒性。
3.6 乙烯利通过提高水稻秧苗抗寒基因表达响应低温胁迫众多基因参与调控水稻响应低温胁迫。过表达的TERF2不仅可以增加渗透物质和叶绿素含量,还能降低ROS和丙二醛(MDA)的含量,减少电解质的渗漏和诱导其他耐冷相关基因的表达[22]。OsCOIN编码环型锌指蛋白,受低温、ABA、盐和干旱强烈诱导。OsCOIN的过量表达,上调了OsP5CS的表达,增加了细胞内脯氨酸含量,最终显著增强了转基因水稻对冷、盐和干旱的抗性[23]。在本试验中,外源施加乙烯利显著增加TERF2和OsCOIN基因的表达,提高了水稻体内的脯氨酸和可溶性糖含量(图 1),说明乙烯利处理会通过提高水稻TERF2和OsCOIN的表达量来增加体内渗透物质的合成,从而缓解水稻秧苗冷胁迫。
OsCDPK7是水稻体内与编码Ca2+依赖蛋白激酶(CDPK)有关的基因,当OsCDPK7基因过表达时,可显著缓解水稻遭受的冷胁迫[24]。在本试验中,外源施加乙烯利显著提高秧苗体内OsCDPK7基因的表达量。这说明低温条件下,乙烯利处理可诱发OsCDPK7的过量表达,从而提高水稻秧苗在低温条件下的抗寒性。
低温会引起脂质双分子层从灵活的液晶相到固体凝胶相的转变,从而触发细胞膜的功能异常,同时膜脂质构象的变化往往会导致细胞内溶质的渗透性增加和泄漏[25]。而OsLti6a基因则可通过保护水稻质膜在低温胁迫下的完整性缓解冷胁迫[26]。在本试验中,外源施加乙烯利显著提高水稻秧苗OsLti6a基因的表达量。说明低温条件下外源施加乙烯利处理会通过提高水稻耐寒基因OsLti6a表达量,从而通过保护质膜的完整性提高水稻在低温条件下的耐寒性。
OsICE1是一个膜相关转录因子,调控冷胁迫诱导的上游转录因子基因如OsDREB1B和OsHsfA3的表达,从而使水稻适应寒冷环境[27]。COLD1是定位于质膜和内质网上的冷敏感基因,它能与G蛋白α亚基RGA1互作以感知低温,激活Ca2+通道,并增强G蛋白GTP酶活性,从而增强水稻的耐寒性[28]。在本次试验中,低温条件下外源施加乙烯利处理会诱导无土基质和发酵基质生长秧苗的冷胁迫基因OsICE1和COLD1的表达量上调,而对于在低温条件下营养土生长的秧苗,外源施加乙烯利处理则会使冷胁迫基因OsICE1和COLD1的表达量下调,这可能是由于基质种类的不同所引起的。
4 结论外源喷施乙烯利显著逆转低温胁迫对水稻生长的抑制作用。乙烯通过提高水稻秧苗对营养元素磷的吸收,提高水稻体内渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量,增强秧苗体内抗氧化系统酶活性,提高水稻秧苗的氧化还原状态(AsA/DHA比率),提高秧苗内冷胁迫基因OsCOIN、TERF2、OsLti6a和OsCDPK7的表达量来提高水稻秧苗的低温抗性。同时,不同育秧基质之间育成的秧苗其耐冷性存在显著差异。
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