2023, Vol. 55
2. 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所), 南京 210008;
3. 江苏丰收大地种业发展有限公司, 江苏盐城 224199
氨挥发是地表氮素损失的一种重要方式[1]。全球年均氨挥发总量约54 Tg，而农田是氨挥发的最大排放源，其中化学氮肥所造成的年均氨挥发总量达11.3 Tg[2]，而中国农田由化学氮肥使用引起的氨排放总量约为3.21 Tg，其中，粮食作物占比为66%[3]。我国农业生产大多使用化学肥料，氮肥使用多以尿素为主，稻田氨挥发可达施氮量的10% ~ 38%[4]，不仅造成了严重的氮资源浪费，也导致了极大的生态环境污染。化肥的过量及不均衡使用，不仅造成我国部分地区农产品质量下降，而且对空气、水、土壤和生物多样性造成威胁，并产生温室气体排放，给环境带来大量的负面效应[5]。从生态环保的角度出发，农业生产过程中，寻找既能环境友好又能保证作物产量的农学措施，是当今农业亟需解决的问题。
影响稻田氨挥发的因素很多，包括田面水NH4+-N浓度、田间水分条件及气候条件、采用的施肥技术及耕作方式等[6]。其中，影响稻田氨排放最主要的因素为田面水NH4+-N浓度，稻田氨挥发的变化趋势与田面水NH4+-N浓度的变化趋势保持一致[7]。田面水pH是影响稻田氨排放的另一大重要因素，在一定范围内，田面水pH升高可促进氨挥发。稻田氨挥发量过高、氮肥利用率低下主要是由于过量施肥和不合理使用化肥等所导致[8]。不同品种氮肥、土壤性质、施肥方法、施肥时期、排水搁田方式和硝化抑制剂施用等都会对氮肥的去向产生影响[9]。不少研究表明，改进施氮技术这一手段可以提高稻田的氮肥利用率，增加水稻产量，同时达到减少由稻田氨挥发而造成的氮损失[10]。以氮肥深施和塑料包膜为代表的新型施肥技术和各种化学抑制剂的应用均能明显减少农田的氨挥发与氮损失[11]。绿肥及其生物固氮作用可以代替一部分化学氮肥，从而降低稻田氮素损失，同时提高水稻氮肥利用率，且绿肥具有可再生、低成本、低氮损失率等诸多优点 [12]。
红萍(Azollaceae，Azolla)是天然的优质绿肥，具有显著的生物固氮能力，且可以富集土中磷钾等多种矿物质养分。近年来研究表明，稻田放养红萍可以抑制杂草生长，降低水温，降低田面水pH，具有减少氨挥发损失、提高氮肥利用率的潜力[13]。与化学氮肥相比，红萍作为生物绿肥有以下优点：成本低、可再生、无污染、繁殖快、生长周期短、生长期长、分解快[14]。红萍的固氮速率为1.0 ~ 3.6 kg/(hm2·d)(以纯N量计，下同)，年固氮量约100 ~ 300 kg/hm2，最高可达670 kg/hm2[15]。因此，稻田养萍被认为是减少氨挥发损失和提高氮肥利用率的新途径。大量实践和试验结果证明，红萍氮对水稻是有效的，在稻田放养红萍有一定程度的增产效果。一季水稻所得红萍相当于70 ~ 100 kg/hm2[14]。红萍的肥效优于其他生物肥料(如蓝藻生物肥料)，在低施氮量下配施红萍可增产10% ~ 30%[16]。稻田养萍可减少化肥氮的投入。
然而，红萍对水体中NH4+-N的耐受能力有限[17]，施用氮肥会抑制红萍生长，减少红萍的生物固氮作用。目前，有关稻田放养红萍模式下红萍的生物固氮作用和稻田氨挥发对不同施氮水平响应的研究未见报道。为了明确稻田养萍模式下，不同施氮量对红萍生物固氮作用和田间氨挥发的影响，本研究采用盆栽试验在0、75、150、225、300 kg/hm2的施氮梯度下，监测了稻田放养红萍和水稻单种各处理的氨挥发通量和固氮速率，以探索不牺牲水稻产量的前提下，红萍以最大潜力减少稻田氨挥发和发挥生物固氮能力的最佳施氮量，为水稻绿色生产提供更加充足的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验于2015年在中国科学院常熟农业生态实验站(31°15′15″N，120°57′43″E)开展。该站位于太湖地区，有75% 的农田为稻田，海拔1.3 m，属于亚热带湿润气候，年均气温为15.5 ℃，年均降水量为1038 mm，年均无霜期224 d。供试土壤为湖积物发育而成的潜育型水稻土(乌栅土)，表层0 ~ 20 cm土壤理化特征：pH(H2O)7.36、有机质35.0 g/kg、全氮2.09 g/kg、全磷0.93 g/kg、CEC 20.2 cmol/kg。供试水稻品种为南粳46，为当地推广栽培品种，稻秧秧龄为30 d。
本研究试图通过盆栽试验探明稻田养萍模式下，不同施氮量对红萍生物固氮作用、稻田氨挥发以及水稻产量的影响。如表 1所示，本试验共设置10个处理，分为不加红萍单施氮肥组(H0)和放养红萍配施氮肥组(H0+A)，每组各5个施氮水平，分别为：0、75、150、225、300 kg/hm2。每个处理3个重复。施用的化肥为：氮肥(尿素，含N 460 g/kg)、磷肥(过磷酸钙，含P2O5 120 g/kg)和钾肥(氯化钾，含K2O 600 g/kg)。所有处理的磷肥(90 kg/hm2)和钾肥(120 kg/hm2)均作为基肥一次性撒施于田面水。尿素分3次均匀撒施于田面水，施肥比例为4:2:4，施用时间为2015年7月16日、7月27日、8月31日。水稻于2015年7月16日移栽，每盆3穴，每穴3株。红萍的放养量为鲜重3 t/hm2，在施基肥前放置于田面水中(覆盖度约90%)，红萍自然生长数天后便能均匀覆盖整个田面。
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表 1 试验处理 Table 1 Test treatments |
NH3挥发采用由密闭室、真空泵、NH3吸收液组成的密闭室间歇通气法测定。密闭室由透明有机玻璃构成，直径20 cm、高15 cm，底部开放。顶部有2个通气孔，通气孔的直径为25 mm，其中一个通过波纹管与采气杆相连，采气杆为2.5 m高；另一个通气孔与洗气瓶相连，洗气瓶中盛有60 mL稀硫酸吸收液(0.05 mol/L)并连接真空泵。密闭室中的气相NH3通过抽气减压的方式被洗气瓶捕获，密闭室内每分钟进行15 ~ 20次换气。采集氨挥发时，氨挥发罩子轻拿轻放，减少对红萍的扰动。从每次施肥后的第1天开始采集，直至NH3挥发通量与空白处理无明显差异结束。吸收液中的NH4+-N采用靛酚蓝比色法测定。田面水的采集与氨挥发检测同时进行，采用紫外分光光度法、便携式pH计和靛酚蓝比色法分别测定田面水的NO3−-N、pH和NH4+-N。在当日7:00—9:00和15:00—17:00进行气体采集，此时的NH3挥发通量被认为是每日平均通量，并通过这一数据估算NH3挥发总量。NH3挥发通量计算公式为：
| $ {F_{{\text{N}}{{\text{H}}_{\text{3}}}}} = C \cdot V \cdot \frac{{24}}{t} \cdot \frac{{{{10}^{ - 2}}}}{{\pi \cdot {R^2}}} $ | (1) |
式中：
水稻成熟后，将每盆水稻地上部分成籽粒和秸秆，风干和称重，计算干物质量。并随机选取一部分籽粒和秸秆样品，在80℃的烘箱中烘干24 h，然后用粉碎机粉碎，过150 μm筛，用凯氏定氮法测定氮含量。
1.2.3 红萍固氮速率的测定红萍的生物固氮速率采用乙炔还原法在田间进行原位测定。红萍的固氮速率对温度敏感，本研究对红萍生物固氮速率的测定依照稻季温度的变化，分别安排在水稻插秧后的第17天、第55天和第75天进行，时间为上午的8:00—11:00，此时的固氮速率被认为是日平均值[18]。
红萍的生物固氮速率(R)和生物固氮量(BNF)的计算公式如下：
| $ R = C \cdot V \cdot t \cdot \frac{{28 \cdot {{10}^{ - 2}}}}{{S \cdot 3}} $ | (2) |
| $ \mathrm{BNF}=R \cdot D $ | (3) |
式中：R为红萍的生物固氮速率；C为乙烯的浓度(mol/L)；V代表培养红萍的体积；t代表培养红萍的时间；S代表测样面积；BNF代表生物固氮量；D代表红萍生长的天数，施肥后红萍的固氮能力会被抑制10 d。
1.3 数据分析与处理采用Excel 2016进行数据处理，Origin 9.4进行相关性分析和作图，SPSS 2017进行方差分析。
2 结果与分析 2.1 NH3挥发日通量及总量如图 1所示，在同一施氮水平下，放养红萍组(H0+A) NH3挥发日通量峰值明显低于不加红萍组(H0)。每次施肥后，H0组各处理的NH3挥发日通量均随时间呈先增后减的变化趋势，且峰值出现在施肥后2 ~ 4 d；H0+A组的NH3挥发峰值较低或没有明显峰值，且各施氮处理迅速下降到与N0处理接近。H0组中，除N75处理外，第一次追肥后NH3挥发峰值较其他两次施肥高，N75处理则是在施基肥后NH3挥发峰值较高。H0+A组3次施肥的NH3挥发峰值并无明显差异，均较低。
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图 1 不同处理氨挥发日通量 Fig. 1 Daily NH3 fluxes of different treatment |
3次施肥相比较，施基肥后，各施肥处理NH3挥发日通量随时间发生波动，约经过8 d才恢复至与空白对照相当；而第一次追肥后，各施肥处理NH3挥发日通量经过约6 d后恢复至与空白对照相当；第二次追肥后，各施肥处理NH3挥发日通量的恢复经过约4 d，用时较短。同时第一次追肥后各施肥处理的NH3挥发日通量明显高于施基肥后，施基肥后各处理的NH3挥发日通量明显高于第二次追肥后。3次施肥后，H0组的N300处理均达到最大峰值，其次为H0组的N150与N225处理，3个处理的最大峰值分别为10.7、7.3、10.9 kg/(hm2·d)，且这3个处理峰值明显高于其他处理。NH3挥发日通量较低的N0、N0+A、N75、N75+A、N150处理在3次施肥过程中没有较大变化，均少于1.0 kg/(hm2·d)。
如表 2所示，在施基肥以及第一、二次追肥后，各处理的氨挥发量均随施氮量的增加而增加，且在不同施氮量条件下放养红萍均能有效抑制氨挥发，氨挥发降低率均在50% 以上。施基肥后，N75+A、N225+A与N300+A处理显著降低NH3挥发量，降低幅度分别为88.7%、82.4% 和76.3%(P < 0.05)。在H0组中，N75和N0处理NH3挥发量较小，为1.87和4.32 kg/hm2，显著小于N300和N225处理(P < 0.05)。在H0+A组中，N300+A处理NH3挥发量最大，达6.68 kg/hm2，显著高于其他处理(P < 0.05)，其次为N225+A处理的4.04 kg/hm2，也显著高于其他处理(P < 0.05)。
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表 2 各处理的氨挥发量(kg/hm2) Table 2 Ammonia volatilization of each treatment |
第一次追肥后，除施氮量75 kg/hm2外，其他施氮量下两处理组的NH3挥发量差异显著(P < 0.05)。H0组中，N300处理的NH3挥发量为30.35 kg/hm2，显著高于其他处理(P < 0.05)，N75与N0处理的NH3挥发量显著低于其他处理(P < 0.05)。H0+A组中，N300+A处理的氮挥发量同样显著高于其他处理，为4.48 kg/hm2(P < 0.05)。
第二次追肥后，放养红萍使N225+A处理氨挥发降低78.2%(P < 0.05)。H0+A组中，N300+A处理的氨挥发量为4.46 kg/hm2，显著高于其余处理(P < 0.05)；而N75+A处理与N0+A处理NH3挥发量较小。
3次施肥后测得的NH3挥发总量除不施氮肥处理外，其余施氮量下放养红萍均能显著抑制氨挥发量(P < 0.05)。并且H0+A组内与H0组内差异相同，施氮量150、225与300 kg/hm2处理之间差异显著(P < 0.05)，施氮量75和0 kg/hm2处理的NH3挥发量显著小于施氮量300、225及150 kg/hm2处理(P < 0.05)。
如图 2所示，H0组的NH3挥发量与施氮量呈线性正相关关系，二者关系式为y=1.6+0.229x (R2=0.961)。H0+A组氨挥发量与施氮量的拟合曲线为幂函数y=0.000416x1.84(R2=0.978)，随施氮量增加，NH3挥发总量增大且增幅变大。
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图 2 H0组(A)与H0+A组(B)氨挥发总量与施氮量的拟合曲线 Fig. 2 Fitting curve between total ammonia volatilization and nitrogen application in group H0 (A) and group H0 + A (B) |
如表 3所示，水稻插秧后第17天，N0+A处理红萍的生物固氮速率最高，显著高于其他处理(P < 0.05)，N300+A、N225+A处理和N0处理的生物固氮速率相似，显著低于N0+A处理与N75+A处理(P < 0.05)。水稻插秧后第55天，N300+A处理红萍的生物固氮速率显著低于N0+A和N75+A处理(P < 0.05)，其他施氮量下红萍的生物固氮速率无显著性差异(P > 0.05)。水稻插秧后第75天，N0+A处理红萍的生物固氮速率最高，其次是N75+A处理，两处理间差异不显著(P > 0.05)，但显著高于其余各处理(P < 0.05)；N300+A处理的固氮速率最低，显著低于其余各处理(P < 0.05)。
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表 3 红萍的生物固氮速率与总固氮量 Table 3 Biological nitrogen fixation rate and total nitrogen fixation of azolla of each treatment |
全稻季红萍的生物总固氮量分析结果与第75天时的固氮速率相似，N0+A处理与N75+A处理的生物固氮速率较高且差异不显著(P > 0.05)，但显著高于其余各处理(P < 0.05)，而N300+A处理的固氮速率最低。如图 3所示，总固氮量随施氮量的增加而减小，二者呈负相关关系，拟合方程为y=85.59–0.228x (R2=0.967)。
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图 3 红萍总固氮量与施氮量的拟合曲线 Fig. 3 Fitting curve between total nitrogen fixation and nitrogen application of azolla |
如表 4所示，除不施氮处理外，各施氮处理添加红萍均能提高水稻产量，但仅施氮量150 kg/hm2处理下有显著性差异(P < 0.05)。不添加红萍时，N0处理与N75处理产量接近，其他处理产量与氮肥用量呈正相关，随氮肥用量提高水稻产量显著提高(P < 0.05)。添加红萍时，水稻产量随施氮量增加而增加，施氮量超过225 kg/hm2后，产量增长停止，N225+A与N300+A处理的产量较高且差异较小，分别为88.07和88.29 g/盆。
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表 4 各处理水稻产量 Table 4 Rice yield of each treatment |
如图 4所示，H0组中水稻产量与施氮量二者拟合曲线为二次函数y=0.000 269x2+0.037 1x+49.1 (R2=0.961)；H0+A组中二者拟合曲线为二次函数y= –0.000 465x2+0.296x+43.1(R2=0.991)。
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图 4 H0组与H0+A组水稻产量与施氮量的拟合曲线 Fig. 4 Fitting curve between rice yield and nitrogen application rate of group H0 (A) and group H0 + A (B) |
本研究中，同一施氮水平下，添加红萍显著降低了NH3挥发日通量及总量，表明放养红萍可有效减少稻田NH3挥发损失。这与前人的研究结果一致。Cissé和Vlek[19]报道，红萍能够通过固定空气中的氮气并释放到土壤中培肥土壤，为水稻生长提供氮源，而且增加养分的有效性，减少氮肥以NH3的形式释放到空气中。Vlek等[20]研究表明，红萍与水稻共作可抑制NH3挥发，且显著降低氮损失，其原因在于红萍吸收了肥料氮的1/4左右，并在稻季后期与其从大气中固定的氮一起释放供作物吸收。而且红萍覆盖田面水会形成一层物理隔膜，既可阻止田面水气相NH3向空气挥发[21]，也可阻挡阳光照进田面水，从而使得藻类难以在田面水中生长，还能阻止田面水温度的迅速升高，从而有利于减少NH3挥发损失[22]。
本研究中，稻田NH3挥发在施肥后呈现急剧增加到峰值再迅速减小的动态变化规律，与田玉华等[23]的结果相同，且这一规律与田面水NH4+-N浓度变化趋势一致。本试验中，施基肥后添加红萍组NH3挥发速率随时间出现波动，有时会出现两个小峰值，与唐良梁等[24]的稻田NH3挥发研究结果类似，不同的是其俩峰值出现在穗肥期，基肥的NH3挥发先剧烈降低再平稳降到痕量。这可能是由于试验设计加入红萍或有机肥对稻田NH3挥发机制产生的影响不同所导致。但两个研究中都发现稻田基肥期和穗肥期氨挥发量差异很大，基肥期氨挥发量要远高于穗肥期。唐良梁等[24]认为，一方面由于基肥期稻田施入有机肥其携带的氮素较多，因而基肥期施肥量相对高于穗肥期；另一方面基肥期水稻处于幼苗期，对氮素需求较少，而且基肥期天气良好、气温偏高，有利于氨挥发，而穗肥期水稻需氮量高，温度相对低于基肥期，且伴有降雨，造成氮素径流损失，不利于氨挥发[24]。
本研究中，未放养红萍组氨挥发量与施氮量呈线性关系增长，而放养红萍组氨挥发量与施氮量呈指数关系增长。这可能是由于随着稻田中施氮量的增加，田面水中NH4+-N浓度提高对红萍产生毒害作用，从而对红萍抑制氨挥发的能力造成影响。邓美华等[25]的研究指出，稻季氨挥发损失量与氮肥施用量呈指数增长关系；叶世超等[26]也指出，在砂土和黏土两种土壤类型上氨挥发损失量随施氮量的增加呈指数增长趋势；同时也有报道指出，早晚稻各生育期及连作周期的氨挥发量均与施氮量呈显著线性关系[27]。Vlek等[20]开展的温室盆栽试验表明，在施氮量为30和60 kg/hm2时，红萍覆盖整个田面水可显著减少NH3挥发，红萍覆盖使氮损失从45% 和50% 显著减少到20% 和13%。本研究与Vlek等[20]的结果有所不同，本研究中的氮肥梯度较大，且最高施氮量达300 kg/hm2(当地常规施氮量)，红萍的生物固氮作用有限，而高施氮量抑制了红萍的生长，使红萍对肥料氮的吸收减少，因此施氮量较大时放养红萍组的NH3挥发迅速增加。目前有关施氮量及放养红萍对氨挥发总量的影响规律还没有统一结果，这可能与地块的土壤类型、有机肥施用、天气状况、土壤pH、田间管理措施等有关[24]。
本研究发现，低氮量处理下放养红萍能够提高稻田的生物固氮速率和固氮量，而高氮量处理下则会抑制红萍生物固氮作用。这与唐建阳等[28]关于红萍在稻田氮素平衡中的研究结果一致，其认为施用磷、钾肥料可促进红萍繁殖和固氮作用，氮肥则有抑制作用。同时，唐建阳等[29]的研究表明，红萍年生物固氮量为244 kg/hm2，而稻季生物固氮量为90 ~ 100 kg/hm2；Singh等[30]研究认为，稻季红萍的生物固氮量最高可达100 kg/hm2。这些结果高于本研究得出的在无氮肥施用情况下稻季红萍生物固氮量约80 kg/hm2。这可能是因为前二者的研究分别位于中国福建和印度奥里萨邦，当地稻季平均温度与本研究相比均较高，且不同研究采用的红萍品种也不同。同时，Singh等[30]建议，可采用长方形水稻插秧行间距来代替传统的等间距正方形插秧方法来提高稻季红萍固氮量。红萍的固氮能力与萍种及环境条件密切相关，在测定其季节固氮量时，还受试验方法、试验时期、对照作物和计算方法等的影响，所以对于红萍固氮量的估值各研究者的试验结果差异较大[29]。
本研究中，在稻田里放养红萍对提高水稻产量具有明显的作用。在多个国家的研究结果表明，红萍作为绿肥还田或水稻生长期间放养红萍，或与尿素配合使用，均增加水稻稻谷产量[31]。Bharati等[32]研究发现，在相同氮肥投入条件下，稻田养萍代替一半的氮肥能够增加水稻产量。本研究中，一半氮肥(150 kg/hm2)时放养红萍处理水稻产量并未高于不加红萍常规施氮(300 kg/hm2)处理的产量；在减施1/4氮肥时，放养红萍处理的水稻产量高于不加红萍常规施氮(300 kg/hm2)处理的产量。但本研究中放养红萍不施氮处理与不加红萍单施氮肥75 kg/hm2处理之间、放养红萍施氮肥75 kg/hm2处理与不加红萍单施氮肥150 kg/hm2处理之间、放养红萍施氮肥150 kg/hm2处理与不加红萍单施氮肥225 kg/hm2处理之间、放养红萍施氮肥225 kg/hm2处理与不加红萍单施氮肥300 kg/hm2处理之间的产量相似，即红萍可以代替75 kg/hm2的氮肥，这可能与气候条件或材料种类有关[32]。Vlek等[20]通过盆栽试验研究发现，在相同施氮条件下养萍处理的水稻产量显著高于无萍处理(P < 0.05)。本研究中施用氮肥后，稻田养萍增加了试验中水稻产量，但只有施氮量为150 kg/hm2时两种种植方式间差异显著(P < 0.05)。而稻田养萍增产的原因一般被认为是红萍给水稻生长提供了氮素养分。也有研究发现，早稻田养萍处理较不养萍处理増产18%左右，稻田养萍主要増加了水稻中后期的营养，促使水稻穗大粒多[33]。
4 结论1) 同一施氮水平下，放养红萍组NH3挥发的日通量峰值及总量明显低于不养萍组，其中施氮量为225 kg/hm2时，两组处理的NH3挥发量差异最为显著。但是随施氮量增加红萍对NH3挥发的生物抑制作用有限且高施氮量会抑制红萍的生长，施氮量较大时养萍组的NH3挥发迅速增加。施氮量越高，红萍对氨挥发的抑制效果越小。NH3挥发速率在施肥后短期内会随时间出现波动，呈现“单峰”或“双峰”状态，而且“双峰”多出现在基肥时期。同时从水稻生长时期看，穗肥期，水稻生长的需氮量高于基肥期，因此穗肥期的NH3挥发量低于基肥期，基于这一研究结果，可以通过适当降低基肥期的施氮量，增加穗肥期的施氮量来提高氮素利用率，减少稻田NH3挥发。
2) 红萍的生物固氮速率及固氮总量与施氮量呈负线性相关，放养红萍不施氮肥处理下稻田的生物固氮速率较高，固氮量最大，但随施氮量增加固氮速率和固氮量降低，固氮作用被抑制。施氮量300 kg/hm2时红萍的生长和生物固氮能力会受到一定程度的抑制，此时得到的固氮速率及总量与不施氮肥不养萍处理之间无显著差异，低量氮肥会促进红萍的生物固氮作用，高量氮肥会抑制红萍的生物固氮作用。
3) 未施氮时放养红萍会减少水稻产量；施加氮肥后，与不养萍处理相比，放养红萍组各处理的水稻产量明显增加，其中施氮量为225 kg/hm2时水稻产量增加最多。在本试验条件下，施氮量300 kg/hm2内放养红萍可以代替约1/4(75 kg/hm2)的氮肥。
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