2023, Vol. 55
2. 中国科学院南京土壤研究所, 南京 210008;
3. 河南大学生命科学学院, 河南开封 475004
青藏高原是全球面积最大、海拔最高的高原，平均海拔为4 378 m，被称为地球的“第三极”。青藏高原生态系统多样性极高，拥有荒漠、草地、森林、湖泊湿地、河流湿地、盐碱地等，且其高寒气候条件和5 000万年前的古海洋生境可能孕育了特有的微生物群落及结构，驱动了青藏高原的物质能量循环，在全球气候变化中扮演了重要的角色。
微生物硝化过程是全球氮素循环的核心环节，是氮素循环中唯一的氧化途径，即将NH4+氧化成NO2–，然后NO2–被进一步氧化成NO3– [1]。前者主要由氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)或氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)驱动，在有氧条件下由氨单加氧酶(ammonia monooxygenase，AMO)催化氨(NH3)氧化为羟胺(NH2OH)，又在羟胺氧化还原酶(hydroxylamine oxidoreductase，HAO)的催化下迅速氧化为亚硝酸盐(NO2–)，该过程被称为氨氧化过程，是硝化过程的限速步骤[2]。后者由亚硝酸盐氧化菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)驱动，通过亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)将亚硝酸盐氧化为硝酸盐。而完全硝化微生物(complete ammonia oxidizer，Comammox或CMX)的发现改变了上百年来的硝化过程必须由两种微生物接力完成的经典研究范式[3–4]。然而这些硝化微生物在青藏高原典型生境中的分布规律和群落结构特征却并不清楚。
本文针对青藏高原荒漠草地、湿地(河流/湖泊)、碱盐地3种典型生境，通过amoA功能基因实时荧光定量PCR(qPCR)、16S rRNA基因扩增子Illumina HiSeq测序等技术手段，解析青藏高原3种典型生境的硝化微生物分布和群落结构特征，将有助于加深对青藏高原硝化过程微生物学机制的认识。
1 材料与方法 1.1 土样采集供试5个土壤的采样地点位于30°N附近的青藏高原，分别为措勤、申扎、纳木错、雅鲁藏布江中游和扎布耶茶卡(图 1)。研究地区属高原山地气候，平均海拔4 000 m以上，年均气温1.7 ℃，年均降水400 mm。本研究共采集了10个样本，将取自措勤和申扎的荒漠草地土壤样本命名为C1、C2、C3、C4，将取自纳木错和雅鲁藏布江中游的湿地土壤样本命名为S5、S6、S7、S8，将取自扎布耶茶卡的碱盐地土壤样本命名为Z9、Z10。
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图 1 5个土壤采样点地理位置示意图 Fig. 1 Locations of five soil sampling points |
使用pH计(Thermo Orion-868，MA，USA)测定土壤pH，水土质量比为5∶1；使用总有机碳分析仪(Multi N/C 3100，Analytik Jena AG，德国)测定土壤可溶性有机碳(DOC)含量；使用连续流动分析仪(San ++ System，Skalar，Holland)测定土壤铵态氮(NH4-+N)、硝态氮(NO3-–N)和溶解性总氮(DTN)含量(表 2)。溶解性有机氮(DON)使用以下公式计算：DON = DTN – (NH4-+N + NO3-–N)。将沉积物风干并将其筛分至2 mm，通过燃烧法测定(Thermo Fisher Scientific Flash Smart Elemental Analyzer，Bremen，Germany)测定土壤全碳(TC)和全氮(TN)含量。ICP-AES Optima 8000仪器(Perkin-Elmer，Waltham，MA，USA)用于测量全磷(TP)和全钾(TK)含量。
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表 1 定量PCR扩增引物及反应条件 Table 1 Quantitative PCR amplification primers and their reaction conditions |
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表 2 土壤的基本理化性质 Table 2 Physicochemical properties of tested soils |
土壤微生物总DNA提取采用Fast DNA Spin kit for soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)。根据试剂盒操作说明提取土壤微生物总DNA，并使用Nanodrop ND-1000超微量分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，美国)和1% 的凝胶电泳检测DNA浓度和质量，将DNA于–20 ℃保藏。
1.4 amoA基因定量PCR利用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher，美国)对青藏高原土壤中AOA、AOB和CMX的amoA基因进行定量分析。反应体系为20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa，日本)，0.8 μL上下游引物(10 μmol/L)，2 μL(约1 ~ 10 ng)模板DNA，补充双蒸水至20 μL。qPCR引物和反应条件见表 1。每个样品设置3个重复，每个重复包含3个测试平行。将含有AOA、AOB和CMX amoA基因的单克隆质粒DNA梯度稀释成101 ~ 109的标准浓度作为qPCR标准曲线。
1.5 16S rRNA基因PCR扩增及高通量测序细菌多样性测定方法：采用16S rDNA序列分析方法，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测定。16S rDNA的PCR扩增：引物为515F 5′-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′和907R 5′-CCGTCAATTCMTTT RAGTTT-3′。PCR的20 μL混合反应体系包括4 μL 5×FastPfu Buffer，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA和10 ng的样本DNA。采用ABI GeneAmp®9700型PCR仪，反应程序：95 ℃预变性3 min；29个循环(95 ℃变性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s)；72 ℃延伸10 min。
测序数据处理：将从Illumina HiSeq测序平台得到的初始数据根据Barcode序列拆分为不同样品数据，并且截去PCR扩增引物序列和Barcode序列；将拆分完成的数据应用FLASH(V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样品的reads进行拼接，拼接序列为原始Tags数据；将原始Tags从连续低质量值(默认质量阈值≤3)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断，进一步过滤去除其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75% 的Tags；与数据库(Gold database，http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)进行比对(UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)，检测嵌合体序列；去除嵌合体序列得到最终的有效数据。
1.6 系统发育进化树构建利用MUSCLE(Multiple Protein Sequence Alignment)软件对代表性序列进行多序列比对，使用Gblocks提取保守序列，然后用IQ-tree软件构建AOA、AOB、NOB的16S rRNA基因系统发育树，通过“-m MF -T AUTO”选择最佳进化模型，利用最佳进化模型，并设置参数“-FMP -bb 1000”，进行进化树构建。
1.7 共现性网络构建为了研究硝化微生物与非硝化微生物，以及硝化微生物与关键环境因子之间的关系，本研究进行了共现性网络(co-occurrence network)分析。筛选出至少在5个样本中出现的OTU之间所有可能的Spearman秩相关。如果Spearman相关系数(r) > 0.6且P < 0.05，则OTU之间存在有效共现性。利用Cytoscape v3.9.0软件生成节点文件和边文件，并通过Gephi v0.9.2对网络进行了可视化。
2 结果 2.1 总微生物群落组成土壤总微生物16S rRNA基因扩增子测序发现，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctobacteria)、芽单胞菌门(Gemmabacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和候选门WPS-1(Candidate division WPS-1)是青藏高原3种生境中丰度最高的微生物类群(图 2A)。NMDS分析发现，不同生境中样品微生物群落显著聚集，其中荒漠草地和湿地微生物群落结构较为接近(图 2B)。进一步的Mantel test分析发现，NH4-+N和pH是驱动总微生物群落结构的主要环境因子(图 2C)。
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图 2 总微生物群落组成(A)、NMDS 分析(B)及与土壤理化性质的曼特尔检验(C) Fig. 2 Total microbial community composition (A)，NMDS analysis (B) and Mantel test with physiochemical properties of soils (C) |
基于amoA基因的qPCR结果揭示，AOA在荒漠草地和盐碱地两种生境中丰度最高，分别为5.26×106 ~ 9.78×106 copies/g和1.42×107 ~ 2.15×107 copies/g，是AOB和CMX amoA基因丰度的1 ~ 2个数量级(图 3)。而特别的是，CMX amoA基因在绝大多数湿地样品中(4个样品中的3个)丰度最高，分别为5.27×104 ~ 2.87×106 copies/g，其丰度与AOA的amoA基因丰度相当或高于AOA，显著高于AOB的amoA基因丰度(图 3)。
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(图中不同小写字母表示同一样地不同氨氧化微生物间差异显著(P < 0.05)) 图 3 基于荧光定量PCR的AOA、AOB和CMX的amoA基因丰度 Fig. 3 amoA gene abundances of AOA, AOB and CMX based on qPCR |
基于16S rRNA基因扩增子测序结果发现，青藏高原3种生境中AOA主要类群为土壤类群(即group 1.1b)，且其中约半数以上属于最新发现的Nitrosocosmicus分支(图 4)，该分支也存在于北极冻土中[8]。3种生境中AOB类群结构也差异显著，荒漠草地、湿地(4个样品中的3个)主要为亚硝化螺菌属(Nitrosospira，71.21% ~ 100%)，而碱盐地主要为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas，75.51% ~ 88.71%)(图 5)。各生境中NOB主导类群均为硝化螺菌属(Nitrospira，70.87% ~ 98.79%)，且lineage II是其主导分支。由于目前已知的CMX均属于该分支，且经典NOB和CMX无法在16S rRNA基因水平进行区分，因此lineage II同时包含了CMX的16S rRNA基因序列(图 6)。硝化菌属(Nitrobacter)仅占3种生境中NOB总序列数的1.22% ~ 29.13%(图 6)。
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图 4 AOA 16S rRNA基因序列系统发育进化树及在不同样本中的相对丰度 Fig. 4 The phylogenetic tree of AOA 16S rRNA genes sequences and the relative abundances in different samples |
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图 5 AOB 16S rRNA基因序列系统发育进化树及在不同样本中的相对丰度 Fig. 5 Phylogenetic tree of AOB 16S rRNA genes sequences and relative abundances in different samples |
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图 6 NOB 16S rRNA基因序列系统发育进化树及在不同样本中的相对丰度 Fig. 6 Phylogenetic tree of NOB 16S rRNA genes sequences and relative abundances in different samples |
特别的是，在多个生境中检测到了典型海洋类群的硝化微生物，如其中一个荒漠草地和一个湿地样品包含了较高比例的海洋类群AOA(即group 1.1a)，分别为12.77% 和51.14%，且主要为海岸口分支(图 4)。而在湿地的两个样品中均检测到了典型海洋来源的AOB，即亚硝化单胞菌属海洋谱系(Nitrosomonas marina)，丰度分别为13.64% 和29.51%(图 5)；而在湿地及盐碱地中均检测到了典型海洋分支的NOB，即lineage 4，丰度为0.64% ~ 3.90%(图 6)。
2.4 硝化微生物网络互作关系微生物共现性网络分析发现，AOA (Nitrososphaera)和Nitrobacter与非硝化微生物物种间多为正相关连接，分别占总连接数的68.40% 和92.13%(图 7A)。而AOB(Nitrosospira)和Nitrospira与非硝化微生物物种间以负相关连接为主，分别占总连接数的65.19% 和52.57%(图 7A)。进一步的硝化微生物与环境因子相关性网络分析发现，DON、DOC、TK和TP是影响AOA(Nitrososphaera)的主要环境因子(图 7B)，多种环境因子(除了TC和NO3-–N)均与AOB(Nitrosospira)有显著相关性，DOC、DON和NH4-+N等多种环境因子均与Nitrospira有显著相关性(图 7B)，而Nitrobacter只有NO3-–N与其有显著的相关性(图 7B)。
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(图 A 展示了硝化微生物与非硝化微生物的相互作用关系；图 B 展示了各硝化 OTU 与土壤理化性质的互作关系，“＋”表示正相关，“－”表示负相关。) 图 7 硝化微生物和其他微生物(A)、土壤理化性质(B)的共现性网络 Fig. 7 Co-occurrence network of nitrifying microorganisms and other microorganisms (A), soil physicochemical properties (B) |
青藏高原被称为地球的“第三极”，总面积高达2.62×108 hm2，其高寒气候条件和多样性的生境以及其古海洋环境，可能塑造了其独特的硝化微生物群落，然而目前对青藏高原硝化微生物种群特征及其分布规律仍知之甚少。本研究以荒漠草地、湿地和盐碱地3种典型生境为研究对象，系统分析了硝化微生物分布规律和群落结构特征，研究发现，AOA、AOB和NOB三种硝化微生物在不同生境中具有独特的类群，如与北极冻土和海洋生境同类群的AOA，且受pH和NH4-+N等多种环境因子的影响。该研究加深了对青藏高原硝化过程微生物生态分布和群落结构的认知。
在土壤总微生物群落结构方面，发现NH4-+N和pH是影响3种生境总体微生物群落最重要的两个环境因子(图 2C)。而NH4-+N和pH也是影响硝化微生物生理代谢活性和生态分布的关键环境因子，暗示了3种生境中硝化微生物群落结构和生态分布的特异性[9]。比如，3种生境中AOA主要类群为土壤类群(即group 1.1b)，且其中约半数以上属于Nitrosocosmicus分支。含有Nitrosocosmicus类群的amoA序列最早发现于土壤生境，被称为29i4[10]，随后在北极冻土中富集到了该类群的菌株，证明该类群能够适应低温环境，这和青藏高原常年低温气候特点相互吻合[8]。Wang等[11]通过稳定性同位素探针技术，首次明确证明该类群可以主导高铵投加条件下水稻土的氨氧化过程。随后国内外多个研究团队在污染土壤[12]、旱地土壤[13]、废水生境[14]和水稻土[15]中分离到了该类群的纯菌株，并把该类群命名为Nitrosocosmicus clade[12]，且发现该类确实可以耐受高浓度铵[13]。Wang等[16]通过生长活性测定、基因组和转录组分析发现，该类群代表性菌株Ca. N. oleophilus MY3可以耐受酸性pH环境，而本研究的3种生境均偏碱性环境。由此可见，Nitrosocosmicus类群可能是目前发现的温度、底物浓度和pH适应范围最为广泛的AOA类群。
在5 000万年前印度与欧亚板块开始碰撞逐渐形成目前的青藏高原之前，该地区曾经是特提斯古海洋(Tethys Sea)。本研究在3种典型生境中大多检测出了典型海洋类群的硝化微生物，如荒漠草地和河流湿地中检出了group 1.1a分支的AOA，且主要属于estuarine/coastal marine clade[16]；另有研究在湖泊中检出了典型海洋来源的Nitrosomonas marine类群的AOB[17]，在河流沉积物中检出了典型海洋分支的NOB，即lineage 4[18]。这一特征在已经研究的农田土壤生态系统中包括湿地等生境的硝化微生物群落中极少发现[9，11，16，19–21]，强烈暗示青藏高原硝化微生物类群除了受近代和当前环境影响，还可能受5 000万年前古海洋环境的影响。另外，值得注意的是，本研究中包括了典型的盐碱地，其具有较高的土壤盐度，而荒漠草地和湿地也具有较高的pH，这有可能是导致以上生境依然保留了部分海洋类群硝化微生物特征的原因之一。
完全硝化微生物(CMX)的发现改变了上百年来硝化微生物研究的经典范式[3–4]。目前发现，CMX在地下水、土壤、河流、湿地、废水处理系统和海岸口等多种生境中广泛分布，但在远洋海水中暂未发现其存在[22–23]。而本研究首次在青藏高原高寒生态系统中发现CMX的存在，且在大多数河流湿地和湖泊湿地中其丰度显著高于AOA和AOB。这说明CMX生境适应的广泛性，暗示CMX在青藏高原氮循环中可能发挥了重要作用。未来纯菌株分离、生理代谢特征和基因组研究，将有助于进一步加深对青藏高于CMX类群生理生态功能的认知。
总之，本研究较为完整地解析了青藏高原3种典型生境中硝化微生物群落结构和分布特征，对认知青藏高原氮循环和微生物生态和遗传进化具有重要意义。
4 结论青藏高原荒漠草地和盐碱地中3种氨氧化微生物的丰度顺序为AOA > CMX > AOB，而在湿地中则为CMX≥AOA > AOB。3种生境中AOA主要类群为土壤类群(即group 1.1b)，且约50% 属于Nitrosocosmicus分支，该分支在北极冻土中也有发现，暗示了该类群能够耐受低温的特征。荒漠草地和湿地中AOB主要类群为Nitrosospira，而碱盐地主要为Nitrosomonas。3种生境中NOB主要类群均为Nitrospira。clade A和clade B分支的CMX在各生境均存在，且二者比例相当。特别的是，大多生境中存在典型海洋来源的硝化微生物类群，如group 1.1a的AOA、N. marina的AOB、Lineage 4的NOB，这强烈暗示青藏高原硝化微生物可能受青藏高原古海洋环境的影响。
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2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
3. College of Life Sciences, Henan University, Kaifen, Henan 475004, China