2023, Vol. 55
2. 福建师范大学地理科学学院, 福州 350007;
3. 中国科学院南京土壤研究所, 南京 210008
反硝化过程是指硝态氮被逐步还原成亚硝态氮、一氧化氮、氧化亚氮(N2O)和氮气的过程，是氮循环的重要组成部分。反硝化过程是农田N2O产生的主要途径[1]，由微生物驱动完成，其中亚硝态氮还原基因nirS和nirK是N2O产生的关键基因，而N2O还原基因nosZ I和nosZ Ⅱ编码的酶是目前已知去除N2O的唯一生物途径[2]。因此，nirS、nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ的丰度和活性直接影响着土壤N2O的排放强度[3]，与全球气候变化息息相关。温度是影响微生物生长和活性的重要因素，而氮添加可为反硝化微生物提供底物，因此，研究温度和氮添加对反硝化微生物功能基因丰度的影响可为旱地农田红壤养分管理提供指导和建议。
在陆地生态系统中，温度可以通过影响土壤微环境、养分有效性、土壤呼吸和微生物群落结构等，从而影响反硝化微生物功能基因和N2O排放[5]。前人研究发现，在湿地土壤中nirS基因丰度主要受温度影响，在低温条件下丰度最高，而nirK受温度影响较小[6]；在黑土中，只有nirS基因的群落结构对温度敏感，且nirS基因丰度与N2O排放显著相关[7]；在红壤中，低温有利于维持反硝化微生物丰度，但显著抑制反硝化微生物活性[8]。另有研究表明，高温显著抑制红壤反硝化微生物的生长和活性[9]。因此，温度对土壤反硝化微生物丰度和活性的影响仍存在较大不确定性。此外，施用氮肥是提高土壤肥力和作物产量的重要田间管理措施，可为土壤微生物提供能量与基质[10]。施用氮肥对反硝化微生物功能基因的影响已有大量报道，但结果差异较大。例如，Hallin等[11]发现，长期施用硫酸铵显著降低nirS、nirK和nosZ基因丰度；Ouyang等[12]则发现，施用氮肥可以提高nirS、nirK和nosZ基因丰度。在红壤中，施用氮肥对反硝化微生物的影响同样存在争议。Xiao等[13]研究指出，有机无机肥配施显著增加红壤nirK和nirS基因丰度；宛颂等[14]则发现，施用化肥显著增加旱地红壤nirS基因丰度，但对nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ基因丰度无显著影响。然而，施用化肥也可能对红壤所有反硝化微生物丰度无显著影响[15]。因此，温度和氮添加对反硝化微生物功能基因丰度的影响仍存在较大争议，有待进一步研究。
另外，前人对nosZ基因的研究大多只关注nosZ I，对后发现的nosZ Ⅱ关注较少。自2012年nosZ Ⅱ发现以来，截至2019年仅有22% 的研究提到nosZ Ⅱ[16]。然而，Jones等[17]发现，环境样品中nosZ Ⅱ的基因丰度与nosZ I相当或更高，暗示着nosZ Ⅱ基因可能在N2O还原过程中起着重要作用。Xu等[18]则进一步研究表明，nosZ Ⅱ在农田土壤中可能扮演着比nosZ I更重要的角色。尽管nosZ Ⅱ不断引起国内外学者的关注，但农田土壤中nosZ Ⅱ对温度和氮添加的响应研究几乎处于空白，制约着对反硝化过程的整体认识。因此，系统研究nirS、nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ基因丰度对温度和氮添加的响应具有重要意义。
红壤广泛分布于我国热带和亚热带地区，总面积达204万km2，约占国土面积的21%[19]，是重要的农业土壤资源。那么，红壤中反硝化微生物功能基因nirS、nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ的丰度对温度和氮添加响应如何？基于该科学问题，本研究设计了不同温度梯度和氮添加水平的培养试验，以期深入了解旱地红壤反硝化微生物功能基因对温度和氮添加的响应，为农田红壤养分管理和生态环境保护提供指导和建议。
1 材料与方法 1.1 试验地概况试验地位于江西省鹰潭市中国科学院鹰潭红壤生态实验站(28°15′20″N，116°55′30″E)，该区域属于中亚热带湿润季风气候，年平均降水量1 795 mm，年平均气温为17.6 ℃。供试土壤为第四纪红色黏土发育而来的典型红壤。
试验样地建设于1988年4月，在1995年以前耕作方式为花生和油菜连作，之后改为夏季花生、冬季休耕的耕作方式。选取当地常规施肥处理的土壤为研究对象，设置3个重复。该处理每年施肥量为N 120 kg/hm2的尿素、P 30 kg/hm2的钙镁磷肥和K 90 kg/hm2的氯化钾，每年4月10日一次性施肥，田间管理措施与当地常规田间管理措施一致。于2019年10月17日，在3个小区内分别按照五点采样法采集表层土壤(0 ~ 20 cm)5个，将每个小区的5个土芯混合均匀，形成1个混合样品，放置在装有冰袋的保温箱中立即送回实验室处理。在微宇宙培养前，用无菌镊子除去碎石和细根等杂物后过2 mm筛。土壤基本理化性质的测定按照文献[20]描述的方法进行，供试土壤的基本理化性质如表 1所示。
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表 1 供试土壤理化性质 Table 1 Soil properties of tested soils |
称取10 g新鲜土壤(烘干重计)于100 mL血清瓶中，分别加入相当于N 0、25、50 mg/kg的硫酸铵溶液，并添加无菌水调节土壤含水量至60% 田间持水量。每个处理设置18次重复，随机分为3组，分别放在15、25、35 ℃恒温培养箱，作为温度处理，避光培养30 d。在培养过程中，每隔2 d打开一次血清瓶进行换气保证好氧培养条件，并根据重量补充培养过程中所损失的水分。在培养的7和30 d后破坏性采集土样，随后将采集的土壤储存在–80 ℃下用于土壤DNA提取。
1.3 土壤总DNA提取和实时荧光定量PCR土壤总DNA提取使用FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)试剂盒，按照说明书操作步骤进行。NirS、nirK、nosZ I和nosZ II的基因丰度采用定量PCR(qPCR)方法利用CFX384 Optical Real-Time Detection System (Bio- Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，美国)仪器进行测定。使用的引物序列、反应体系、反应条件和标准曲线同宛颂等[14]。每个样品重复3次，并设置3个阴性对照。根据标准曲线计算反硝化功能基因的丰度。本试验中各反应的熔解曲线均为单峰，扩增效率均介于90% ~ 100%，R2均为0.999。
1.4 数据处理数据统计分析采用SPSS19.0软件进行。利用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各处理间反硝化功能基因丰度的差异。采用3因素方差分析(Three-factor ANOVA)探讨温度、氮添加和培养时间及其交互作用对反硝化功能基因丰度的影响。所有数据在分析之前进行同质性和正态分布检验。采用邓肯法(Duncan’s test)进行差异显著性检验(α=0.05)。采用OriginPro 2021软件绘图。
2 结果与分析 2.1 温度和氮添加对nirS和nirK基因丰度的影响从图 1可以看出，不同处理土壤nirS基因丰度为4.29×106 ~ 6.49×107 copies/g。在培养7 d后，nirS基因平均丰度在25 ℃时最高，为3.09×107 copies/g；当温度升高至35 ℃时，nirS基因平均丰度显著降低至6.22×106 copies/g；而温度降低至15 ℃时，nirS基因平均丰度与25 ℃时差异不显著。在培养30 d后，nirS基因丰度在15 ℃时最高，为2.44×107 ~ 3.16×107 copies/g。随着培养温度增加nirS基因丰度显著降低，在35 ℃时最低，为6.38×106 copies/g。
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(图A、图C为培养7、30 d后温度对nirK和nirS基因丰度的影响；图B、图D为培养7、30 d后氮添加对nirK和nirS基因丰度的影响。不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)；框中的横线表示中位数，框的底部和顶部分别代表下四分位数和上四分位数，在框上方和下方延伸的线和方点表示异常值；下同) 图 1 温度和氮添加对nirK和nirS基因丰度的影响 Fig. 1 Effects of temperature and nitrogen addition on abundances of nirK and nirS genes |
对于nirK基因，在培养7 d后，其平均丰度在25 ℃时最高，为2.76×107 copies/g；35 ℃时显著降低至7.28×106 copies/g，而15 ℃时与25 ℃时无显著差异。在培养30 d后，nirK基因丰度随着温度增加而降低，在15 ℃时最高，为2.32×107 copies/g (图 1)。
此外，与无氮添加处理相比，氮添加处理对土壤nirS和nirK基因丰度均无显著性影响(图 1)。通过3因素方差分析发现，温度、温度和培养时间、氮添加和培养时间、温度与氮添加和培养时间的交互作用显著影响nirS和nirK基因丰度(表 2)。
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表 2 温度、氮添加和培养时间对反硝化功能基因丰度影响的3因素方差分析 Table 2 Three-factor ANOVA of effects of temperature, nitrogen addition and incubation time on abundances of denitrifying functional genes |
由图 2可知，在培养7 d后，不同处理土壤中nosZ Ⅰ基因丰度为9.60×106 ~ 7.80×107 copies/g。在25 ℃时nosZ Ⅰ基因平均丰度最高，为4.81×107 copies/g，但培养温度升高至35 ℃或者降低至15 ℃时，nosZ Ⅰ基因丰度显著下降。在培养30 d后，nosZ Ⅰ基因丰度随着培养温度增加显著降低，在35 ℃时nosZ Ⅰ基因丰度最低为1.13×107 copies/g。
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(图A、图C为培养7、30 d后温度对nosZ Ⅰ和nosZ II基因丰度的影响；图B、图D为培养7、30 d后氮添加对nosZ I和nosZ II基因丰度的影响) 图 2 温度和氮添加对nosZ I和nosZ II基因丰度的影响 Fig. 2 Effects of temperature and nitrogen addition on abundances of nosZ I and nosZ II genes |
对于nosZ Ⅱ基因，在培养7 d后，3种温度处理对其丰度均无显著性影响。但培养30 d后，nosZ Ⅱ基因丰度随着温度升高而显著降低，在15 ℃时平均丰度最高，为5.72×107 copies/g(图 2)。
此外，不同氮添加处理土壤中nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ的基因丰度无显著性差异(图 2)。3因素方差分析结果表明，温度、温度和培养时间、温度与氮添加和培养时间的交互作用会显著影响nosZ I和nosZ Ⅱ基因丰度。此外，nosZ I基因丰度还受氮添加以及温度和氮添加的交互作用影响(表 2)。
3 讨论研究表明，增温会通过影响土壤微生物的活性，加速土壤氮素矿化，对土壤氮循环过程产生深远的影响[21]。反硝化过程是氮循环的重要组成部分，调控着氮素的还原与转化，在土壤N2O的排放中扮演重要角色。土壤反硝化微生物功能基因丰度可以一定程度上反映土壤的反硝化潜力[22]。本研究发现，培养7 d后，nirS和nirK基因丰度在25 ℃时最高，表明nirS和nirK基因型微生物在短期内更喜好25 ℃的生存环境，低温和高温均不利于其生长。然而，随着时间推移，在培养30 d后，nirS和nirK基因丰度在15 ℃时最高，且随着温度升高而下降。这可能是由于nirS和nirK基因型微生物对15 ℃有更好的适应性，能够将更多的能量用于自身的生长。这与Lee和Francis[6]在旧金山湾沉积物中的研究结果一致，他们发现nirK的基因丰度在温度最低的冬季时最高，表明这类微生物喜好低温环境。最近的一项meta分析同样表明，增温分别降低陆地生态系统nirS和nirK基因丰度31% 和26%[5]。一方面，这可能是因为nirS和nirK基因型微生物喜好相对厌氧的环境[23]，温度升高会促进土壤的水分蒸发，使得土壤水分含量下降，趋于干燥，从而不利于反硝化微生物的生长；另一方面，温度升高使土壤的氮素周转加快，反硝化微生物的底物供应不足，从而不利于nirS和nirK基因型微生物的生长[24]。
本研究发现，氮添加对土壤nirS和nirK基因丰度没有显著影响，这和大多数以往的研究不同。一项针对农田土壤的meta分析发现，施用氮肥分别显著提高nirS和nirK基因丰度40% 和53%[12]。Yang等[25]同样发现，施用氮肥会显著影响农田土壤nirS和nirK基因丰度和群落结构。然而，Xiao等[13]认为，nirS的基因丰度和群落结构受有机肥的影响更大，化肥的影响相对较小。本研究中，nirS和nirK基因丰度不受氮添加影响，这可能是由于供试土壤是长期(32年)施肥的土壤，土壤中的反硝化微生物已经长期适应氮添加的环境[26]，因此，反硝化微生物丰度对氮添加响应不强烈。Tian等[27]同样发现，氮添加对土壤反硝化基因丰度没有显著影响。此外，Ning等[28]研究发现，低氮添加处理会显著增加nirK基因丰度，而高氮添加处理会显著降低nirK基因丰度，因此，氮添加量会显著影响反硝化微生物功能基因丰度对氮添加的响应。与Ning等[28]研究相比，本研究的氮添加量介于低氮和高氮之间，这可能是nirS和nirK基因丰度对氮添加没有响应的一个因素。当然，也有可能是由于30 d的培养时间还不足以使供试土壤反硝化微生物丰度发生变化。
和nirS和nirK基因类似，nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因丰度培养7 d后在25 ℃时最高，而在培养30 d后随着温度升高而降低。反硝化nirS和nirK基因是产生N2O的关键基因，而N2O是nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ型微生物的底物[29]。因此，nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因丰度可能受底物影响，与nirS和nirK基因丰度呈现出相似的变化趋势。Xing等[30]同样发现，nosZ微生物群落结构在15 ~ 35 ℃温度范围内受温度显著影响。相反，Li等[4]发现，nosZ基因丰度不受温度影响。因此，nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因丰度对温度的响应可能受土壤理化性质和微生物的群落结构控制。此外，本研究发现，氮添加对土壤nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因丰度无显著影响，一方面可能是由于nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因型微生物在土壤环境中具有较强的适应能力，对氮添加可能有较好的适应性[31]；另一方面可能是由于nirS和nirK基因丰度不受氮添加影响，导致nosZ Ⅰ和nosZ Ⅱ基因型微生物的底物来源不变。综上，温度变化显著影响反硝化功能基因丰度，而氮添加对反硝化功能基因丰度的影响较小(图 3)。因此，土壤反硝化微生物功能基因丰度可能会呈现出季节性差异，也可能随着昼夜温差发生改变，在土壤采样时应特别注意。此外，不同的反硝化微生物功能基因之间对温度和氮添加呈现出相似的响应规律，表明这几类反硝化微生物之间存在着一定的联系。
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图 3 温度和氮添加对反硝化基因丰度影响的概念图 Fig. 3 Conceptual diagram illustrating effects of temperature and nitrogen addition on abundances of denitrifying functional genes |
供试红壤在微宇宙试验中培养7 d后，nirS、nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ基因丰度均在25 ℃时最高；随着时间推移，在培养30 d后各基因丰度在15 ℃时最高，且随着温度升高而下降。氮添加对土壤nirS、nirK、nosZ I和nosZ Ⅱ基因丰度无显著影响。可见，反硝化功能基因丰度受温度显著影响，而受氮添加的影响较小。
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2. School of Geographical Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China;
3. Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China