土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成成分，在维持土壤生态系统平衡、促进土壤养分循环、保障作物正常生长发育方面发挥着重要作用，是反映土壤健康的重要指标^[1]。前人研究发现，有机肥与化肥配施，能够增加土壤细菌和真菌群落的丰富度和多样性指数，改变土壤微生物群落结构^[2-3]。但是由于有机肥种类和土壤类型的不同，有机肥和化肥配施对土壤微生物的影响目前还存在较大差异。王庆等^[4]研究发现，化肥减量配施有机肥能够增加土壤细菌的多样性，但对土壤真菌多样性没有影响；而李正辉等^[5]研究则表明，羊粪有机肥的施用对土壤真菌的群落结构影响尤为显著。

烤烟是我国重要的经济作物之一。近年来，由于无机肥料的不合理施用，造成土壤酸碱平衡失调、土壤生物活性降低以及土壤肥力下降等问题，严重影响了烟田的土壤健康和烟区的可持续发展^[6]。施用有机肥能够降低土壤容重，改善土壤细菌群落结构和土壤养分供应能力，有利于土壤培肥和健康^[7-8]。羊粪有机肥是常见的有机肥类型之一。前人研究表明，羊粪有机肥替代化肥减量配施，能够改善土壤肥力，增加土壤微生物多样性，建立更适合作物生长的微生物区系^[9]。然而，烟田配施羊粪有机肥对植烟土壤的改良效应及其微生态机制，仍不十分清楚。本课题前期研究发现，40% ~ 60% 羊粪有机肥替代化肥与化肥配施能够促进烤烟生长发育，维持土壤肥力^[10]，但是并未对土壤微生物多样性进行深入探究。因此，本研究采用高通量测序技术，进一步分析了腐熟羊粪有机肥与化肥配施对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响，旨在为洛阳烟区合理利用羊粪有机肥改良烟田土壤提供科学依据。

试验于2019年在河南省洛阳市河南科技大学进行。供试土壤釆自河南科技大学农场0 ~ 20 cm耕层，除去石子等杂物后风干过2 mm筛备用。土壤类型为黄潮土，基本理化性质为pH 7.6，有机质12.32 g/kg，全氮0.84 g/kg，碱解氮43.70 mg/kg，有效磷14.10 mg/kg，速效钾102.10 mg/kg。供试烤烟品种为中烟101，烟苗由洛阳市宜阳县烟草公司集中漂浮育苗。供试羊粪有机肥(有机质497.0 g/kg、氮14.2 g/kg、磷13.2 g/kg、钾24.4 g/kg)由河南正辉肥业有限公司生产；供试无机肥为复合肥(N∶P₂O₅∶K₂O=18∶18∶18)、过磷酸钙(P₂O₅，160 g/kg)和硫酸钾(K₂O，500 g/kg)。

试验采取盆栽受控试验，共设4个处理，分别为：CK(不施肥)、T0(100% 无机氮肥)、T50(50% 羊粪有机肥氮+50% 无机氮肥)、T100(100% 羊粪有机肥氮)，每处理重复4次，共16盆。3个施肥处理T0、T50和T100，按N∶P₂O₅∶K₂O=1∶1.5∶3进行配施，确保各处理氮、磷、钾等量施用，具体施肥比率和用量见表 1。于烟苗移栽60 d后，用抖根法采集烤烟根际土壤，混合均匀，一部分风干用于测定土壤养分含量和土壤酶活性，另一部分装入无菌离心管，放入液氮保存，用于DNA提取。

表 1 Table 1

表 1 不同处理肥料配比和用量 Table 1 Fertilizer application ratios and dosages in different treatments 处理 N来源(%) P2O5来源(%) K2O来源(%) 肥料施用量(g/pot) 羊粪 化肥 羊粪 化肥 羊粪 化肥 羊粪 复合肥 过磷酸钙 硫酸钾 CK - - - - - - - - - - T0 0 100 0 100 0 100 0.00 2.22 1.25 1.60 T50 50 50 31 69 29 71 14.08 1.11 1.34 1.31 T100 100 0 62 38 57 43 28.17 0.00 1.43 1.03

表 1 不同处理肥料配比和用量 Table 1 Fertilizer application ratios and dosages in different treatments

参照鲍士旦^[11]的方法测定土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量。参照关松萌^[12]的方法测定土壤酶活性。其中，土壤蔗糖酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定，以1 g土壤在37℃培养24 h后生成的葡萄糖的质量(mg/(g·d))表示；土壤蛋白酶活性采用加勒斯江法测定，以1 g土壤在37℃培养24 h后生成的甘氨酸的质量(mg/(g·d))表示；土壤脲酶活性采用苯酚钠–次氯酸钠比色法测定，以1 g土壤在37℃培养24 h后产生的NH₃-N的质量(mg/(g·d))表示。

采用土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA® Spin Kit for Soil)进行土壤DNA提取，将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。细菌扩增引物采用515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CC GTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，真菌ITS1区段扩增引物采用ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′)。PCR采用25 µL反应体系：10倍PCR buffer 5 µL，dNTP 0.5 µL，正向反向引物各0.5 µL，Tap酶0.25 µL (250 U)，DNA模板1 µL，dH₂O补齐至25 µL。PCR反应策略：98℃预变性3 min，98℃ 15 s，50℃ 30 s和72℃ 30 s，共27个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

Illumina PE250测序：将同一样本的PCR产物混合后用2% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱；2% 琼脂糖电泳检测。并用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量。使用Illumina PE250构建文库：①连接“Y”字形接头；②使用磁珠筛选去除接头自连片段；③利用PCR扩增进行文库模板的富集；④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的PE250平台进行测序(上海元莘生物医药科技有限公司)。

使用fastp^[13]软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH^[14]软件进行拼接：①过滤read尾部质量值20 bp以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20 bp，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的read；②根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接(merge)成一条序列，最小overlap长度为10 bp；③拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛除不符合序列；④根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。然后，使用Usearch^[15]软件对所有序列进行OTU在97% 相似水平下的划分，采用RDP classifier贝叶斯算法对97% 相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，使用Mothur软件计算细菌和真菌群落的Alpha多样性指数(ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数)。

采用Excel 2016软件进行数据处理，图表中数据为平均值±标准误。采用SPSS 22.0统计软件对土壤养分、土壤微生物Alpha多样性和群落结构等数据进行多重比较、方差分析和相关性分析，使用Origin 9.5对土壤微生物群落多样性与土壤环境因子的Pearson分析、土壤微生物群落组成和NMDS (非度量多维尺度)分析进行作图，采用图图云平台(https://www.cloudtutu.com)和Adobe Illustrator 2021对ANOSIM相似性分析进行作图。

由表 2可知，不同施肥处理间土壤养分含量和酶活性存在显著差异。土壤有机质含量和蔗糖酶活性表现为T100 > T50 > T0 > CK，以单施有机肥的T100处理最高，且T100处理的有机质含量显著高于其他处理，但蔗糖酶活性在T100和T50处理之间没有显著差异；有效磷含量、速效钾含量和蛋白酶活性均表现为T50 > T100 > T0 > CK，以有机肥和无机肥配施的T50处理最高，且显著高于其他处理；碱解氮含量和脲酶活性表现为T50 > T0 > T100 > CK，均以T50处理最高，且显著高于其他处理。

表 2 Table 2

表 2 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤养分含量和酶活性的影响 Table 2 Effects of chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure on soil nutrient contents and enzyme activities 处理 有机质(g/kg) 碱解氮(mg/kg) 有效磷(mg/kg) 速效钾(mg/kg) 蔗糖酶(mg/(g·d)) 蛋白酶(mg/(g·d)) 脲酶(mg/(g·d)) CK 10.33 ± 0.52 c 40.37 ± 3.23 c 11.79 ± 0.47 c 97.94 ± 0.99 c 6.55 ± 0.59 b 0.53 ± 0.05 d 0.29 ± 0.03 c T0 10.55 ± 0.55 c 57.60 ± 2.41 b 17.35 ± 1.35 b 132.33 ± 4.02 b 8.01 ± 0.63 b 0.70 ± 0.03 c 0.43 ± 0.03 b T50 13.94 ± 0.33 b 72.85 ± 0.86 a 23.11 ± 0.45 a 162.68 ± 2.88 a 10.87 ± 0.15 a 1.33 ± 0.01 a 0.74 ± 0.01 a T100 16.23 ± 0.40 a 55.70 ± 1.86 b 18.59 ± 0.49 b 137.33 ± 1.67 b 12.32 ± 1.34 a 1.02 ± 0.03 b 0.41 ± 0.02 b 注：表中同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)；下同。

表 2 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤养分含量和酶活性的影响 Table 2 Effects of chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure on soil nutrient contents and enzyme activities

土壤微生物的丰富度用ACE和Chao1指数表征，多样性用Shannon和Simpson指数表征。由表 3可知，T50处理的土壤细菌和真菌OTU数量最多，ACE、Chao1和Shannon指数最高，Simpson指数最低。土壤细菌的OTU数量、ACE和Chao1指数均表现为T50 > T100 > CK > T0；土壤细菌的Shannon指数以及土壤真菌的OTU数量、ACE和Chao1和Shannon指数均表现为T50 > T0 > T100 > CK；土壤细菌的Simpson指数表现为T50 < T0 < CK < T100，土壤真菌的Simpson指数表现为T50 < T0 < T100 < CK。

表 3 Table 3

表 3 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤微生物Alpha多样性的影响 Table 3 Effects of chemical fertilizer reduction combined with decomposed sheep manure on alpha diversity of soil bacteria and fungi 微生物 处理 OTU数量 ACE指数 Chao1指数 Shannon指数 Simpson指数 细菌 CK 2 843 ± 67 a 3 424 ± 71 a 3 391 ± 70 a 6.25 ± 0.03 b 0.007 6 ± 0.001 0 a T0 2 766 ± 144 a 3 330 ± 125 a 3 298 ± 126 a 6.36 ± 0.02 ab 0.005 2 ± 0.000 4 b T50 3 012 ± 57 a 3 557 ± 40 a 3 521 ± 46 a 6.42 ± 0.02 a 0.004 5 ± 0.000 2 b T100 2 916 ± 107 a 3 493 ± 88 a 3 450 ± 76 a 6.33 ± 0.04 ab 0.008 0 ± 0.001 5 a 真菌 CK 404 ± 31 b 472 ± 38 b 470 ± 38 b 2.65 ± 0.15 c 0.220 0 ± 0.039 6 a T0 525 ± 13 a 594 ± 7 a 602 ± 8 a 3.76 ± 0.11 b 0.048 9 ± 0.006 9 b T50 558 ± 13 a 628 ± 12 a 625 ± 12 a 4.01 ± 0.08 a 0.037 9 ± 0.006 6 b T100 512 ± 17 a 581 ± 16 a 571 ± 20 a 3.49 ± 0.12 b 0.082 8 ± 0.019 4 b

表 3 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤微生物Alpha多样性的影响 Table 3 Effects of chemical fertilizer reduction combined with decomposed sheep manure on alpha diversity of soil bacteria and fungi

通过Pearson分析（图 1）发现，土壤细菌的OTU数量、ACE、Chao1和Simpson指数与土壤环境因子相关性不明显，Shannon指数与碱解氮、有效磷、速效钾含量和脲酶活性均呈极显著正相关关系，与蛋白酶活性呈显著正相关关系。土壤真菌的OTU数量、ACE、Chao1和Shannon指数均与碱解氮、有效磷、速效钾含量和蛋白酶活性呈极显著正相关关系，与脲酶活性呈显著正相关关系；Simpson指数与碱解氮、有效磷、速效钾含量和脲酶活性均呈极显著负相关关系，与蛋白酶活性呈显著负相关关系。说明土壤环境因子变化对土壤真菌的丰富度和多样性影响更为明显，其中土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量和蛋白酶、脲酶活性的变化是影响土壤微生物群落多样性的重要环境因子。

(图A：细菌；图B：真菌；*和**表示在P < 0.05和P < 0.01水平上显著相关) 图 1 土壤微生物群落多样性与土壤环境因子的Pearson相关分析 Fig. 1 Pearson correlation analysis of soil microbial community diversity and soil environmental factors

由图 2A可知，各处理土壤细菌群落的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，平均相对丰度分别为24.76%、23.94% 和14.71%。由图 2B可知，T50处理的变形菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和装甲菌门(Armatimonadetes)的相对丰度最高，放线菌门、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度最低，其中T50处理的放线菌门显著低于其他3个处理。浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度表现为T100 < T0 < T50 < CK，蓝藻细菌门(Cyanobacteria)相对丰度表现为T100 > CK > T50 > T0。

(图A：细菌门水平的相对丰度；图B：细菌门水平的显著差异分析；不同小写字母表示不同处理间差异显著(P < 0.05)，下同) 图 2 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤细菌门水平物种组成的影响 Fig. 2 Effects of chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure organic fertilizer on species composition of soil bacteria at phylum level

由图 3A可知，各处理土壤真菌群落的优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，平均相对丰度分别为62.85% 和31.31%。由图 3B可知，与CK处理相比，施肥处理显著提高了子囊菌门和接合菌门(Zygomycota)的相对丰度，显著降低了担子菌门的相对丰度，T50处理具有最高的子囊菌门和接合菌门相对丰度，最低的担子菌门相对丰度。

(图A：真菌门水平的相对丰度；图B：真菌门水平的显著差异分析) 图 3 腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对土壤真菌门水平物种组成的影响 Fig. 3 Effects of chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure on species composition of soil fungus at phylum level

由图 4A所示，沿X轴CK、T0、T50和T100处理之间有一定距离，但是分离不明显，说明施肥与否能够改变土壤细菌的群落结构，但不同处理对土壤细菌群落结构影响差异不明显。相比土壤细菌的群落结构，4个处理土壤真菌的群落结构分离趋势更明显；沿X轴CK处理与施肥处理分离明显，但各施肥处理间分离趋势不明显(图 4B所示)，说明施肥能够明显改变土壤真菌的群落结构，但不同的施肥处理对土壤真菌群落结构影响差异不明显。由图 5可知，当组间距离大于处理距离时，说明组间差异大于组内差异，R值与P值则说明组间差异达到了显著水平。由图 5A可知，对于土壤细菌，施肥处理与CK处理相比差异不显著，但T50处理与T0、T100处理差异显著；由图 5B可知，对于土壤真菌，各处理间具有显著差异。

图 4 腐熟羊粪有机肥配施无机肥下土壤细菌(A)和真菌(B)群落NMDS分析 Fig. 4 NMDS analysis of soil bacterial (A) and fungal (B) communities under chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure

图 5 腐熟羊粪有机肥配施无机肥下土壤细菌(A)和真菌(B)相似性分析 Fig. 5 Similarity analysis of soil bacteria (A) and fungi (B) under chemical fertilizer combined with decomposed sheep manure

土壤速效养分含量反映了土壤的供肥能力，与烟株的生长发育及产量形成密切相关^[10]。本研究表明，相比于不施肥(CK)、单施化肥(T0)和单施有机肥(T100)处理，50% 羊粪有机肥氮+50% 无机氮肥(T50)处理显著地提高了烟株移栽60 d后土壤碱解氮、有效磷和速效钾的含量，而且相比于CK和T0处理也显著地提高了土壤有机质的含量，说明T50处理兼具供肥和土壤改良效果。土壤酶是土壤中较为活跃的有机成分，在土壤养分循环中发挥着重要作用，其中土壤蔗糖酶、脲酶和蛋白酶是驱动土壤碳氮元素循环的关键酶^[16]。赵霞等^[17]在甘肃省张掖市通过施用不同比例的羊粪有机肥发现，施用羊粪有机肥处理土壤蔗糖酶和脲酶活性与单施化肥处理相比显著增加。秦秦等^[18]在常州市研究不同量生物有机肥与化肥减量配施发现，高量生物有机肥与化肥配施可以增加土壤蔗糖酶和蛋白酶的活性。本研究结果也发现，不同施肥处理对土壤酶活性的影响有明显差异，T50处理土壤蔗糖酶、脲酶和蛋白酶活性均最高。究其原因，羊粪有机肥和化肥配施一方面兼顾了无机氮源对土壤微生物的启动作用，另一方面施入土壤后的腐熟羊粪有机肥为微生物生长提供了大量碳源，有利于微生物增殖，从而提高土壤酶活性^[19]。

土壤微生物是土壤微生态的重要组成成分，是驱动土壤养分循环的关键因子，对维持土壤质量及促进植物生长等具有重要作用^[20]。本研究发现，相较其他处理，T50处理的土壤细菌丰富度和多样性最高。王亚麟等^[21]在贵州的长期定位施肥试验也表明，有机肥与化肥配施能够提高土壤细菌多样性和丰富度。本研究结果还表明，施肥处理均较不施肥处理显著增加了土壤真菌的多样性，且以T50处理土壤真菌多样性最高，这与Luo等^[22]通过研究猪粪、矿质氮、磷酸盐和钾肥混合施入土壤能够显著增加土壤真菌多样性的结果是一致的。有机肥与无机肥配施对土壤细菌和真菌的促生作用与无机肥的启动作用(氮源)和有机肥的底物作用(碳源)耦合有关^[23]。本研究通过分析不同处理土壤细菌群落的组成发现，植烟土壤细菌群落的优势菌门主要为变形菌门、酸杆菌门和放线菌门；T50处理能够提高变形菌门和酸杆菌门的相对丰度，降低放线菌门的相对丰度。由于变形菌门的主要功能为提高土壤氮肥利用率^[24]，而酸杆菌门的主要功能为参与腐殖质分解的碳循环过程及维持土壤生态系统健康^[25]，进一步印证了腐熟羊粪有机肥与化肥配施在提升植烟土壤供肥能力和维持土壤碳氮平衡方面的作用。放线菌门的变化则可能与土壤团聚体大小有关。有研究表明，有机肥与化肥配施能够显著提高土壤的团聚性，而土壤团聚体粒径的增加则会导致放线菌门的相对丰度降低^[26]。通过分析不同处理土壤真菌群落的组成发现，子囊菌门和担子菌门是本研究植烟土壤真菌群落的优势菌门，T50处理提高了子囊菌门的相对丰度，但降低了担子菌门的相对丰度。子囊菌门的主要功能为参与土壤有机质分解，尤其具有分解木质纤维素的能力，因此子囊菌门的相对丰度升高有利于植烟土壤外源有机质的矿化和养分释放^[27]。担子菌门主要出现在贫瘠的营养环境中，与土壤的C/N比呈显著负相关关系^[28]。本研究中，羊粪有机肥的添加通过影响土壤C/N比，导致了担子菌门相对丰度的降低。

Pearson相关性分析发现，供试植烟土壤的速效养分含量和酶活性与土壤中细菌的Shannon指数、真菌的多样性和丰富性指数(ACE、Chao1和Shannon指数)呈显著正相关关系，与土壤真菌的Simpson指数呈显著负相关关系，表明土壤真菌群落结构的丰富度和多样性较土壤细菌群落更容易受到施肥的影响。这是因为土壤真菌主要存在于团聚体表面，相对于细菌更容易受到微环境变化的影响^[29]。Suzuki等^[30]研究也发现，土壤真菌群落结构对有机肥和无机肥配施的响应比土壤细菌群落结构更为敏感。

腐熟羊粪有机肥配施无机肥显著影响植烟土壤肥力、酶活性及土壤细菌和真菌群落结构。土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量及蛋白酶和脲酶活性与土壤微生物群落多样性的关系密切。有机肥与无机肥配施通过调控土壤有机质含量和微生物的多样性，进而影响植烟土壤的供肥能力和土壤质量。腐熟羊粪有机肥与无机肥配施(T50)处理增加了土壤微生物的多样性和丰富度(尤其是土壤真菌)，显著提高了土壤优势菌门的相对丰度，有利于改善植烟土壤的供肥能力，提升土壤质量，在豫西烟区具有较大的推广价值。