2023, Vol. 55
2. 安徽省土壤肥料总站, 合肥 230001;
3. 中国农业大学资源与环境学院, 北京 100091;
4. 安徽荟农生物科技有限公司, 合肥 230036
我国农作物秸秆资源丰富，年产量约为10亿吨[1]。秸秆还田可以改善土壤结构并提高作物产量，是其资源化利用的有效方式之一[2]。然而，秸秆本身由难降解的纤维素、半纤维素和木质素组成，直接还田时腐解缓慢，不能在短时间内完全腐解，种植茬口紧时会造成翻耕困难以及影响后茬作物的生长[3]。因此，加快还田秸秆腐解是当前农业亟待解决的问题之一。
目前，国内外利用微生物降解还田秸秆的研究较多，为了满足农业生产中的抗病、促生等多方面需求，选育具有多重功能的秸秆降解菌株逐渐成为研究热点[4]。齐永志等[5]从麦玉秸秆还田土壤中筛选得到一株对小麦纹枯病菌具有拮抗作用的秸秆降解菌株；吴晓华等[6]从120株地衣真菌中筛选出具有溶解无机磷、抑制病原菌且对黄瓜具有促生功能的高效降解纤维素菌株。然而不同环境中纤维素降解菌群的多样性和结构存在差异[7]，菌种之间分泌的纤维素酶的组分比例和活性也不同[8]。在实际应用时，常常受到培养条件等因素制约，存在菌株纤维素酶活力低、发酵生产成本高等问题[9]。因此筛选高产纤维素酶菌株并且优化其发酵条件是纤维素分解和转化利用的关键[10]。
砂姜黑土质地黏重、干缩湿胀，是分布于安徽淮北平原的主要中低产田土壤[11]。有研究表明，长期秸秆还田可以减缓砂姜黑土孔隙土体的收缩，提升土壤水、养库容[12]；小麦或玉米秸秆还田后配施适量氮肥，可以降低砂姜黑土中N2O排放量和全球变暖潜力[13]。但还田秸秆腐解不及时导致的“泡沫田”问题可能会影响后茬作物出苗质量[14]。而吲哚乙酸(IAA)作为一种植物生长调节剂，可以促进植物种子萌发、根系发育以及营养生长[15]。因此，在砂姜黑土地区中筛选具有促生功能的秸秆降解菌(如产吲哚乙酸菌株)进行腐秆剂创制和应用是实现该地区秸秆资源化利用和作物增收的重要途径。
本研究拟从砂姜黑土地区中筛选具有促生功能的秸秆降解菌，丰富地区腐秆菌株资源，为适用于砂姜黑土区应用的高效腐秆菌剂开发奠定基础；同时对所筛选的菌株进行最佳生长、产酶以及产吲哚乙酸条件分析，为腐秆菌剂在安徽淮北平原地区的科学应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品菌种筛选分离采样点位于安徽省蒙城县内农业示范科技园区长期秸秆还田试验小区(116°56'E，33°26'N)，该定位试验始于2008年，小区面积为49.5 m2。供试土壤为砂姜黑土，土样采集于2012年小麦收割后，采取五点取样法采集土壤，有机质12.5 g/kg，全氮1.18 g/kg，碱解氮80.2 mg/kg，有效磷15.4 mg/kg，速效钾100.3 mg/kg，pH 6.32。种植制度为小麦–玉米一年两熟轮作制度，小麦品种为“烟农19”，玉米品种为“郑单958”。
1.1.2 培养基LB培养基、无机盐培养基、液体发酵培养基、富集培养基和羧甲基纤维素培养基按照程鹏等[16]、陈俊梅等[17]的方法配制。
1.2 试验方法 1.2.1 土壤理化性质的测定土壤碱解氮、有效磷和速效钾指标的测定方法参考《土壤农化分析》 [18]。
1.2.2 菌株的分离与筛选称取10 g新鲜土样于250 mL锥形瓶(装有玻璃珠和90 mL无菌水)，置于摇床(120 r/min、30℃)振荡30 min，取上清液进行梯度稀释，涂布于LB琼脂平板，在30 ℃恒温培养箱中培养直至长出菌落，选择单菌落划线纯化。将分离纯化的菌株接种于羧甲基纤维素钠选择培养基上培养，观察菌落透明圈的大小，定性筛选具有产羧甲基纤维素酶活(CMC)能力的菌株；产吲哚乙酸(IAA)能力的定性测定参照Libbert和Manterffel[19]的方法。
1.2.3 羧甲基纤维素酶活(CMC)和吲哚乙酸(IAA)含量测定所分离菌株的CMC酶活性采用DNS法[20]测定，酶活单位按国际单位定义；产物IAA含量的测定采用Salkowski方法[21]。
1.2.4 菌株的生理生化和16S rDNA分子学鉴定菌株的形态和生理生化特性参照《常见细菌系统鉴定手册》[22]和《伯杰细菌鉴定手册》[23]的相关描述进行鉴定，并对菌株进行电镜扫描观察。细菌基因的提取及16S rRNA扩增测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成，将测序得到的菌株序列在NCBI数据库进行BLAST序列比对分析，使用MEGA11.0软件的Neighbour- Joining法构建系统发育树，以此来鉴定菌株的种属。
1.2.5 菌株秸秆促腐和作物促生能力研究秸秆促腐能力测定：试验设置2个处理，接菌处理(X2，三角瓶中接种10 mL浓度为1×108 cfu/mL菌液和对照处理(CK，三角瓶中接种10 mL无菌水)。将小麦秸秆粉碎研磨后过20目筛，称取5 g于250 mL三角瓶中，依次加入30 mL无菌水、2 g硝酸钠以及10 mL菌液恒温振荡(28 ℃、120 r/min)。培养15 d后，将发酵产物从三角瓶中倒出，用无菌水反复冲洗多次，80℃烘干至恒重。秸秆相对腐解率(%)=(W0-W1)/W0×100，其中，W0为发酵前秸秆物质量，W1为发酵后秸秆物质量[16]。
植株促生能力测定：采集田间0 ~ 20 cm土层的新鲜砂姜黑土，过5 mm孔径筛，每盆装5 kg土，调节含水量至田间持水量的60%；玉米种子用0.1% 的HgCl2表面灭菌10 min，无菌水冲洗多次，每盆播种5粒种子；取浓度为1×108 cfu/mL的菌悬液10 mL接种于土壤，对照土壤喷洒经过灭菌处理的菌悬液(等量菌株121℃、30 min高温高压灭菌即得灭活菌株)，每个处理重复3次。自然条件下生长49 d后采样，测定玉米SPAD(Soil and Plant Analyzer Development)值、根长、株高、地上部干物质量、地下部干物质量以及土壤理化性质[24]。
1.2.6 菌株的最佳生长、产酶和产IAA条件研究保持培养基其他成分不变，碳源为小麦秸秆粉，选取初始pH、装液量和氮源3个因素，进行单因素优化。设置初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，250 mL三角瓶中培养液装液量分别25、50、75、100和150 mL，氮源为硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素和蛋白胨，培养60 h后测定菌株产CMC酶的含量[25]。
设置相同初始pH、装液量和氮源，配置50 mL LB液体培养基(含100 mg/L L-色氨酸)于250 mL三角瓶中，按照1%(V/V)量进行菌株接种，于摇床(30 ℃、180 r/min)培养24 h后测定菌株生长情况(OD600)和产IAA能力。
1.3 数据处理采用Excel 2016对数据进行预处理，使用SPSS 21.0进行统计分析，采用最小显著性差异法(LSD检验)进行数据的方差分析，显著水平0.05；用Origin 2023进行绘图。
2 结果与分析 2.1 不同供试菌株CMC酶活和IAA生产能力比较羧甲基纤维素钠选择培养基筛得7株纤维素降解菌X1 ~ X7(图 1)，其中菌株X2产生的CMC酶活最高，可达18.0 U/mL，显著高于其他菌株(图 1A)。经过产IAA的定性筛选，共有4株产IAA菌株，分别为X1、X2、X4和X5，定量测定结果显示X2产IAA能力最高为13.0 mg/L(图 1B)。
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(图中小写字母不同表示菌株间差异显著(P < 0.05) 图 1 不同菌株产CMC酶(A)和产IAA能力(B) Fig. 1 CMC enzyme activities (A) and IAA syntheses (B) of different strains |
根据LB平板划线显示，观察到X2菌株表面光滑，边缘整齐，颜色略带黄色，质地均匀(图 2A)；通过电镜观察，菌株呈稍弯曲或弧状的棒状(图 2B)。菌株X2的生理生化指标见表 1，X2为好氧性菌株，除了柠檬酸盐利用为阳性，其余反应皆为阴性。扩增菌株X2的16S rDNA序列，并进行BLAST比对，结果(图 3)表明，X2菌株与普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)的亲缘关系最近，Blast比对相似度达99.64%。综合形态学观察、生理生化特征结果以及分子鉴定结果，X2菌株被鉴定为普沙根瘤菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心专利保藏编号：CGMCC No.20912)。
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图 2 菌株X2的菌落形态观察(A)和电镜观察(B) Fig. 2 Observations of colony (A) and electron microscopy (B) of X2 strain |
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表 1 菌株X2的生理生化特征 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of X2 strain |
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图 3 基于X2和相关菌株的16S rDNA序列采用邻接法建立的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of X2 and related strains based on 16S rDNA sequences by adjacency method |
秸秆降解试验表明，在15 d时，接种X2处理的小麦秸秆降解率为16.1%，与对照相比提高了65.4% (P < 0.05，表 2)；盆栽试验表明，玉米植株的平均直径、根表面积和地上部干物质量在接种菌株后都显著增加，较对照分别增加22.0%、28.6% 和33.3% (P < 0.05，表 2)，植株生长状况显著优于对照；接种菌株后盆栽土壤中养分的变化如表 2所示，与对照相比，土壤中碱解氮、有效磷和速效钾含量均有提高，其中土壤中碱解氮含量显著提高了72.7%(P < 0.05，表 2)。
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表 2 接种菌株X2对秸秆促腐、玉米生长和土壤理化性质的影响 Table 2 Effects of inoculation X2 strain on straw decomposition, maize growth and soil physiochemical properties |
X2菌株在pH为6 ~ 9时，生长良好，过酸过碱都不利于菌株生长。当pH为6.0时，菌株生长量最大(图 4A)。三角瓶装液量为25 mL/250 mL时，菌株X2生长状况最优，菌株生长量与装液量呈负相关关系(图 4B)。在不同氮源条件下，该菌株利用有机氮源酵母粉效果最好，蛋白胨其次(图 4C)。
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(图中小写字母不同表示不同培养条件下差异达P < 0.05显著水平；N1 ~ N7：硝酸钾、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、谷氨酸、尿素、蛋白胨) 图 4 不同培养条件对菌株X2生长状况、产CMC酶活力和IAA能力的影响 Fig. 4 Effects of different culture conditions on growth status, CMCase activity and IAA capacity of X2 strain |
设置不同的pH条件测定X2菌株产CMC酶活力。如图 4D所示，在偏酸条件下，X2菌株产CMC酶活能力较强，当pH为5.0时，菌株的产酶能力最强为24.8 U/mL；碱性条件下，产CMC酶活能力较差。当三角瓶装液量为25 mL/250 mL时，CMC酶活最高，为37.6 U/mL，菌株产CMC酶活力与装液量呈负相关关系(图 4E)。当氮源为酵母粉时，此时CMC酶活最高为19.5 U/mL(图 4F)。
X2菌株产IAA的最适pH与最佳生长pH一致，不同条件下，菌株活性变化趋势也一致；当pH为6.0时，IAA分泌量可达15.0 mg/L(图 4G)。装液量为25 mL时产IAA能力显著高于其他处理(P < 0.05)，可达22.1 mg/L(图 4H)。在供试的7种氮源中，X2菌株利用酵母粉分泌IAA量最佳，可达39.7 mg/L (图 4I)。
3 讨论 3.1 菌株X2产CMC酶和产IAA能力国内外对微生物分泌多种酶系进而降解秸秆的研究已有较多报道，细菌因其可以快速繁殖生长而备受关注。Li等[26]从固体垃圾填埋场中筛选出一株可以降解有机固体废物纤维素细菌FLX-7，通过优化发酵条件后CMC活性为11.94 U/mL；钟斌等[27]从沼渣堆肥中分离出纤维素降解菌F3的CMC酶活性为2.73 U/mL。对比分析下X2产CMC的能力较强。此外，近些年来已有研究报道称Rhizobium pusense具有产IAA、增溶磷酸盐、固氮、形成ACC脱氨酶和铁载体等必要的植物生长促进性状[28]。唐嘉城等[29]从百香果植株的根系分离出Rhizobium pusense细菌BXG81的IAA分泌量为7.55 mg/L；Chaudhary等[28]从植物根部分离出Rhizobium pusense MB-17的IAA分泌量为15.5 µg/mL，而本研究所筛选的菌株IAA分泌量为13.0 mg/L，可能是菌种差异以及土壤环境条件不同导致IAA分泌量有所不同。
3.2 菌株X2秸秆促腐和作物促生能力微生物腐解秸秆是一个连续的过程，采用菌株的瞬时酶活力去评估其降解能力存在一定的局限性[30]。为了验证菌株的实际降解能力，本研究进行了液态发酵试验。结果表明，在15 d时，接种X2菌株处理的小麦秸秆腐解率为16.1%。目前，已有文献报道了从砂姜黑土中筛选出菌株玉米固氮螺菌和纤维化纤维微细菌，但这些菌株在相同时间内对小麦秸秆的腐解率为15.1% 和12.2%[24, 31]，相较之下X2菌株具有一定优势。根瘤菌作为植物促生菌可以促进多种植物生长(包括非豆科植物)[32]。Nguyen等[33]研究发现接种Rhizobium pusense对油菜和白萝卜的生长具有显著的影响，还能抑制病原菌在水稻根际生长。本研究筛得菌株可以促进玉米根表面积和地上部干物质量的结果与此一致。此外该菌株还能改善砂姜黑土缺磷少氮的养分含量特性，相对于对照，提高了土壤72.7%的速效氮含量，这有助于宿主植株从土壤中吸收更多的营养物质[34]。
3.3 菌株X2的生产和应用优化菌株在实际应用过程中受到环境条件等因素的制约，其功能发挥的稳定性与室内试验不一定一致[35]。根据菌株特性优化其培养条件，匹配适宜的环境，对微生物的生长及特定性能的发挥应用至关重要[36]。本试验对菌株X2生长、产CMC以及IAA的最优条件进行分析，研究发现X2在pH为6.0、250 mL三角瓶装液量为25 mL、氮源为酵母粉条件下生长和产IAA能力最优，产酶的最佳pH发生变化为5.0。在不同培养条件下，X2菌株生长量和IAA分泌量的变化趋势一致，说明pH可能主要通过影响菌株的生长进而影响IAA分泌量。在pH分别为5.0、6.0时产CMC、IAA能力和生长活性最佳，这一结果表明X2具有耐酸性，与已局部酸化的砂姜黑土相适配。值得注意的是，当pH > 5.0时，该菌株产CMC能力显著下降，这可能是因为随着初始pH升高，菌株的生长量增加，会使菌株积累其他代谢产物，从而抑制纤维素酶的产生[37]。X2生长、产酶和产IAA的最佳装液量为25 mL/250 mL，菌株活性与装液量呈负相关关系。一方面，X2为好氧菌，氧气含量的减少导致菌体生长和代谢减缓，从而导致分泌IAA和CMC酶活的能力下降；另一方面，过高的装液量可能引入更多的代谢废物，对菌株活性产生抑制作用[38]。有机氮源酵母粉具有蛋白质含量丰富、矿物质种类丰富的特点[39]。在本研究中菌株生长、产酶和产IAA的最佳氮源均为有机氮源酵母粉，当使用无机氮源时，菌株X2生长状况不佳，IAA产量也较低，说明菌株X2利用有机氮源的能力优于无机氮源。这与刘延波等[40]筛选的特基拉芽孢杆菌以及刘璐等[41]筛选的芽孢杆菌属在酵母粉为唯一氮源时，分别产酶能力最佳、IAA分泌量最高结果相一致。综上，菌株X2适用于施用有机氮源、通气性好的偏酸性土壤中。
4 结论本研究成功从安徽淮北砂姜黑土农田中分离筛选一株具有促生功能的秸秆降解菌株普沙根瘤菌X2(Rhizobium pusense)，并探明其最佳生长条件pH为6.0，装液量25 mL/250 mL，氮源为酵母粉；其最佳产酶和IAA条件pH为5.0 ~ 6.0，最佳装液量、氮源与生长条件一致。同时，通过盆栽试验发现，该菌株对促进砂姜黑土地区作物生长和土壤养分具有积极的意义。本研究后续也将进一步研究如何有机复配具有不同功能的微生物，使其协同增效为砂姜黑土地区提供优异的微生物菌群。
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2. Anhui Soil and Fertilizer Station, Hefei 230001, China;
3. College of Resources and Environmental Sciences, China Agricultural University, Beijing 100091, China;
4. Anhui Huinong Biotechnology Co., Ltd., Hefei 230036, China