在我国烟草生产过程中，长期过量施用化肥现象较为严重，导致植烟土壤有机质含量下降，土壤结构不良，生物活性降低，肥力水平下降，难以满足优质烟叶生产所需的土壤环境和营养条件^[1]，不利于烟叶品质的提升。目前，土壤有机培肥引起了各地的重视，有机态氮是有机肥中氮素存在的主要形式，需经过矿化后才能被烟草吸收利用^[2]。土壤氮转化酶作为矿化过程的主要生物催化剂^[3]，其活性高低可以反映土壤中氮素代谢的旺盛程度、土壤氮素转化及供给能力的强弱，进而能在一定程度上反映植物对氮素的吸收利用状况^[4]。氮矿化相关功能微生物主要通过相关功能基因的表达来影响各过程中关键酶的合成，来调控土壤氮矿化过程^[5]。不同有机肥能改变土壤微生物生长所需能量物质的数量和质量，进而调控土壤微生物群落的结构和代谢功能，导致氮素矿化特征的差异^[6]。有机肥的施用改变了土壤氮素形态结构和氮库特征，对烟株氮素供应强度和动态会产生显著影响，认识不同有机肥氮素矿化规律对于合理选择和施用有机肥，科学调整无机氮施用量，促进土壤氮素供应与烟株需肥规律相吻合具有重要意义。目前，关于有机肥提高烟叶品质的研究多集中在其种类、施用方式及施用量等方面，由于对有机培肥后土壤氮素矿化规律认识不足，施用有机肥的烟田常出现氮素动态供应不合理，后期供氮滞后等问题，影响了有机肥施用效果。鉴于此，本研究以典型浓香型烟区河南许昌的土壤为研究对象，选用生产上有代表性的植物源有机肥、芝麻饼肥、生物质炭有机肥3种肥料进行室内培养，研究不同有机肥对土壤氮素矿化特征、土壤酶活性的影响，以及有机肥施入下土壤氮素矿化的微生物机制，为筛选利于优质烟草生产的有机肥，制定科学合理的有机肥施用制度提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试土壤及有机肥

供试土壤取自浓香型烤烟代表产区河南许昌(113°55′E，33°95′N)，该区属北暖温带季风气候，年均气温16.30 ℃，年均降水量91.34 mm，降水主要集中在7—9月，该地土壤为黄河沉积物发育的潮土。于烟株移栽前采集2 ~ 20 cm耕层土壤，在采样地按“S”形设置5个采样点，将各点土样混合，室内自然风干后去除石砾和动植物残体等，磨细过0.01 mm筛。一部分土壤用于测定基础理化性质(表 1)，其余土壤于4 ℃冷藏保存以备室内培养。供试有机肥主要成分见表 2，其中植物源有机肥(T)由大理洱海生物肥业有限公司提供，生物质炭有机肥(S)由贵州毕节市烟草公司提供，芝麻饼肥(B)由河南许昌市烟草公司提供。

1.2 试验设计

试验共设置4个处理：植物源有机肥(T)、芝麻饼肥(B)、生物质炭有机肥(S)、不添加有机肥(CK)，每个处理3次重复。各有机肥添加量均按纯N 100 mg/kg土壤进行折算。称取50 g土样装入100 mL三角瓶中，将有机肥与土壤充分混匀，加入蒸馏水调节至65% 田间持水量，于30 ℃恒温培养28 d，期间每隔3 d通过称重法补充瓶内水分。于培养的第7、14、21、28天破坏性取样，测定土壤中NO₃^--N、NH₄⁺-N含量。土壤中蔗糖酶、脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶的测定使用第14、28天采集的土样，土壤微生物群落功能多样性分析使用第14天采集的土样。

1.3 测定方法 1.3.1 土壤理化性质的测定

土壤pH按照土水比1∶2.5(m∶V)混合后用pH计测定；全氮(TN)含量测定采用硫酸–催化剂消解–凯氏定氮法^[7]；土壤有机质(SOM)采用重铬酸钾容量法–外加热测定；碱解氮测定采用碱解扩散法^[8]；土壤田间持水量用环刀法测定^[9]；土壤NO₃^--N、NH₄⁺-N含量测定均使用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)，并根据试剂盒使用说明书进行操作。

1.3.2 土壤酶的测定

使用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定，按照试剂盒说明书进行操作。土壤脲酶(urease，UE)活性采用靛酚蓝比色法测定，土壤蔗糖酶(sucrase，SC)活性采用3, 5-二硝基水杨酸溶液比色法测定^[10]，土壤硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)活性采用可见分光光度法测定，土壤蛋白酶(NPT)活性采用福林酚比色法测定。

1.4 土壤微生物群落分析 1.4.1 DNA提取和PCR扩增

土壤总DNA的提取采用HiPure Soil DNA Kit试剂盒(型号D3142，广州美基生物科技有限公司)，并用带有barcode的特异引物对提取的细菌基因组进行PCR扩增。用341F(5′-CCTACGGGGGCWCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)引物对细菌16S rDNA基因在V3-V4可变区进行PCR扩增^[11]。扩增后的PCR产物经2% 浓度的琼脂糖凝胶电泳检测合格后进行纯化，构建测序文库，将纯化产物使用Novaseq PE250测序平台进行上机测序。

1.4.2 OTU聚类与物种注释

用Usearch软件对获得的基因序列进行大规模筛选，并以97% 的相似性将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)^[12]，使用QIIME软件包挑选序列集合中丰度最高的序列作为各个OTU的代表序列，这些代表性序列集合用RDP Classifier的Naïve Bayesian assignment算法，与数据库进行物种注释(设定置信度的阈值为0.8 ~ 1.0)，获得各分类水平上的群落组成。

1.5 数据处理分析及指标计算 1.5.1 数据处理及分析

利用Excel 2011进行数据统计，用Origin 2021作图，通过SPSS 17.0用多重比较法(LSD)进行差异显著性检验(P < 0.05)。基于已分类的OTU，利用Qiime软件进行细菌alpha多样性分析^[13]。利用R软件包(R Studio)绘制OTU分类水平上的Upset图^[14]、属水平物种间相关性网络图、主成分分析图(principle component analysis，PCA)、冗余分析图(redundancy analysis，RDA)、门水平物种分布堆叠图^[15]、属水平物种分布热图^[16]。利用Bugbase软件进行细菌7类生态功能预测^[17]。

1.5.2 指标计算

相关指标采用以下公式计算：

土壤矿质氮含量= NO₃^--N含量+NH₄⁺-N含量

土壤表观硝化速率=(各时段土壤NO₃^--N含量–初始土壤NO₃^--N含量)/培养天数

土壤净矿化速率=(各时段土壤矿质氮含量–初始土壤矿质氮含量)/培养天数

2 结果与分析 2.1 不同有机肥添加下植烟土壤有机氮素矿化特征 2.1.1 不同有机肥添加下植烟土壤无机氮矿化量

由图 1A可知，在整个培养过程中，T、B、S处理土壤NO₃^--N含量在各个时间段均显著高于CK处理。B、S处理土壤的NO₃^--N含量在培养第21天时达到峰值，在培养第28天有所降低。由图 1B可知，在培养过程中，NH₄⁺-N含量总体上呈逐渐降低的变化趋势。在培养第7、21天添加有机肥显著增加了土壤NH₄⁺-N含量，以B处理的提升效果最显著。培养结束时，NO₃^--N含量表现为S > B > T > CK，NH₄⁺-N含量表现为S > B > CK > T。

由图 1C可知，在整个培养过程中，各处理矿质氮含量整体呈逐渐增加的趋势，添加有机肥可以显著增加土壤矿质氮含量。在培养的前14 d，B处理的土壤矿质氮含量最高；然而后14 d，S处理的土壤矿质氮含量逐渐上升并显著高于其他处理。在第28天，各处理土壤矿质氮含量表现为S > B > T > CK，且各处理差异显著。

2.1.2 不同有机肥添加下植烟土壤无机氮矿化速率

由图 2可知，在整个培养过程中，T、B、S处理土壤硝化速率、矿化速率在各个时间段均高于CK处理。在培养的前14 d，土壤硝化速率、矿化速率表现为B处理高于其他处理，而在后14 d则为S处理最高。随时间推移，各处理的硝化速率、矿化速率均表现为先升高后快速降低，最终缓慢降低的趋势；在第7天时硝化速率、矿化速率均达到峰值，以B处理硝化速率最高为11.21 mg/(kg·d)，矿化速率最高为10.00 mg/(kg·d)。

2.2 不同有机肥添加下土壤酶活性变化

由图 3A可知，在培养过程中，硝酸还原酶活性呈逐渐升高的趋势。在培养的第14天，T、S处理土壤硝酸还原酶活性显著提高，B处理则显著降低；在培养结束时，相较CK处理，T、S处理的土壤硝酸还原酶活性分别增加25.54%、13.20%，B处理则降低13.94%。由图 3B可知，不同有机肥对土壤脲酶活性影响有差异，在培养的第14天，与CK处理相比，B、S处理土壤脲酶活性显著提高，T处理则显著降低；在培养结束时，相较CK处理，T、S处理的土壤脲酶活性分别增加7.14%、28.94%，而B处理则降低10.80%。由图 3C可知，在培养的第14天，不同有机肥均能显著提高土壤蔗糖酶的活性，其中以芝麻饼肥提升效果最为明显；在培养结束时，相较CK处理，B、S处理土壤蔗糖酶活性分别增加35.17%、19.87%，T处理则降低3.00%。由图 3D可知，在培养的第14天，芝麻饼肥、生物质炭有机肥显著提高了蛋白酶活性，植物源有机肥也有提升效果，但与CK处理差异不显著；在培养结束时，则表现为T > B > CK > S。不同有机肥对土壤蛋白酶活性影响差异显著，相较CK处理，T、B处理的土壤蛋白酶活性分别增加35.00%、16.28%，而S处理则降低16.26%。

2.3 不同有机肥添加对土壤细菌群落及多样性的影响 2.3.1 土壤细菌群落α、β多样性分析

由图 4A可知，随着测序深度的增加，稀释曲线趋于平缓且测序数据达到饱和，测序数据量能够覆盖本研究中绝大部分土壤微生物群落，可以进行下一步分析。

细菌群落主坐标分析结果如图 4B所示，PC1轴和PC2轴对样本组成差异的贡献值分别为65.18% 和25.00%。S处理的各样本都聚集到一个象限，与CK、T、B处理距离较远，说明CK、T、B处理的细菌群落结构相似，但与S处理相比差异较大。PCA分析结果表明，添加不同有机肥改变了土壤细菌群落组成结构。

Simpson指数和Shannon指数用来评价群落的多样性，ACE指数、Chao指数用来反映群落的丰富度。细菌α多样性指数显示(图 5)：S处理土壤细菌Simpson指数和Shannon指数均高于其他处理，且显著高于CK及T处理，说明S处理土壤细菌群落物种多样性高于其他处理。各处理ACE指数和Chao指数无显著差异，由高到低依次为S、CK、T、B处理，说明S处理土壤细菌群落物种丰富度最高，B处理最低。

2.3.2 细菌群落物种组成

图 6为不同有机肥添加下土壤细菌OTU聚类所得的Upset图，共检测到OTU数为5 211，4个处理共有OTU数为1 398。CK、T、B、S处理检测到的特有OTU数分别为750、759、720、821。相较CK处理，T、S处理OTU数分别增加1.20%、9.47%，B处理则处理降低4.00%。根据OTU分类学分析结果(图 7A)可以看出，变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)为优势菌门(相对丰度 > 5%)。由图 7B可知，S处理的酸杆菌门相对丰度与CK、T处理差异不显著，但显著高于B处理；B处理的拟杆菌门相对丰度显著高于其他处理；S处理的浮霉菌门相对丰度与CK处理差异不显著，但显著高于T、B处理。

由图 8可知，属水平上相对丰度排名前10的菌属有鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、RB41、Flavisoli­bacter、溶杆菌属(Lysobacter)、Stenotrophobacter、苔藓杆菌属(Bryobacter)、Pontibacter、黄杆菌属(Flavitalea)、AKYG587、Terrimonas，其中鞘氨醇单胞菌属、RB41为优势菌属(相对丰度 > 3%)。不同样品组的细菌组成及丰度存在明显差异，Sphingomonas、Pontibacter、Terrimonas在CK处理中最高，RB41、苔藓杆菌属、AKYG587在S处理中最高，Flavisolibacter、Lysobacter、Stenotrophobacter、Flavitalea在B处理中最高。

2.3.3 土壤酶活性与微生物相关性分析

将属层级的物种组成及所测得的土壤酶活性进行共线分析(RDA1=87.62%，RDA2=10.33%)，箭头射线代表不同酶，射线越长表示该酶影响越大；样本/菌群–虚线中心连线与箭头之间的夹角代表了样本/菌群与酶之间的相关关系。从图 9可以看出，硝酸还原酶活性对细菌群落属水平组成影响较大，RB41与硝酸还原酶活性正相关，Sphingomonas与酶活性均呈负相关，蛋白酶活性对细菌群落属水平组成影响较小。

为进一步研究不同细菌对土壤酶活性的响应情况，采用相关性网络图展示土壤酶与物种的Pearson相关性(相关系数0.5≤|r|≤1，P < 0.05)(图 10)。在相对丰度排名前10的属中，排名第一的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)与蔗糖酶活性呈正相关关系，与脲酶、硝酸还原酶均呈负相关关系。RB41与蔗糖酶呈负相关，而与脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶均呈正相关。Flavisolibacter、Lysobacter与硝酸还原酶呈显著负相关，与蔗糖酶呈正相关。Bryobacter与4种酶均呈正相关。

2.3.4 细菌BugBase表型预测

由图 11可知，通过BugBase表型预测出各处理中土壤细菌的9种潜在类型，各处理土壤细菌均以好氧菌、移动元件菌、生物膜形成菌、革兰氏阴性菌、致病性菌、氧化胁迫耐受菌为主。好氧菌、生物膜形成菌、致病性菌相对丰度在各处理间无显著差异；移动元件菌以T处理最高，且显著高于S处理，但与CK、B处理无显著差异；革兰氏阴性菌相对丰度表现为CK处理显著高于B、S处理，与T处理差异不显著；氧化胁迫耐受菌相对丰度表现为S处理显著高于T处理，但与其他处理差异不显著。

3 讨论 3.1 有机肥对土壤氮素矿化的影响

不同有机肥由于自身特性不同，施入土壤后的矿化能力不同^[18]。本研究结果显示，培养结束时，T、B、S各处理土壤矿质氮含量较CK处理分别增加了5.34%、20.21%、25.42%。施用有机肥能促进原生土壤有机质的矿化分解形成可溶性有机氮，同时有机肥中的部分有机化合物在矿化分解过程可转化形成小分子的可溶有机氮^[19]，使土壤可矿化有机氮库增加。在培养前14 d，B处理矿化量及矿化速率最高，而后期为S处理的氮素矿化量、矿化速率高于其他处理。不同有机肥自身性质的差异可能是造成这一结果的重要原因：芝麻饼肥全氮含量高，短期的供氮能力较强，肥效发挥较快，在施入土壤后能够迅速分解，有机氮快速分解为无机氮^[20]；而生物质炭有机肥含水量明显低于其他有机肥，避免了后期因有机肥施用造成的土壤含水率过高形成土壤中过度还原的条件，增加土壤透气性以便加速后期土壤氮素的转化，将土壤氮从惰性库转化到活性库中，同时引起土壤自身有机氮的激发作用^[21]。在整个培养过程中NH₄⁺-N含量逐渐降低，而NO₃^--N含量逐渐升高，这是因为风干土样在经过适宜的水分和温度调节时激活了土壤中微生物和酶活性，并对其产生的不稳定氮素进行矿化分解，这一过程主要是以氨化作用为主，使NH₄⁺-N含量升高^[22]，但在充足的氧气条件下，氨化作用释放出的铵或氨在土壤中硝化细菌的作用下氧化为硝酸盐，使NO₃^--N含量增加^[23]。B、S处理的NO₃^--N含量在培养第21天达到峰值后下降，可能与NO₃^--N的反硝化作用有关，土壤NO₃^--N在土壤微生物及酶的作用下不断进行反硝化作用，向N₂、NO和N₂O等含氮气体转化^[24]。在培养第28天，与反硝化作用相关的硝酸还原酶活性增强，是导致土壤NO₃^--N含量降低的重要原因。

3.2 有机肥对土壤微生物性质的影响

微生物多样性是土壤质量和肥力评价的重要依据^[25]。在本研究中，各施肥处理较不施肥处理的微生物多样性明显提升，施用有机肥能够有效改善土壤理化性质，提高土壤肥力，并且为土壤细菌提供良好的生长环境^[26]。其中以施用生物质炭有机肥对细菌丰富度及多样性提升作用最明显，生物质炭巨大的比表面积和疏松多孔的结构可以为细菌生存提供良好的生长空间和附着位点^[27]。由于土壤酶主要来自微生物细胞，因此，土壤细菌数量的变化势必导致土壤酶活性的变化。本研究表明，T、S处理土壤脲酶活性显著提高，这与各处理土壤细菌数量的变化相一致，可能原因是：有机肥的添加增加了土壤有机质含量，使得土壤酶活性免遭变性或降解，土壤整体脲酶水平增加和活性增强^[28]，脲酶活性的增强使得土壤中无机氮含量增加。

不同碳源的有机肥可能诱导土壤中喜好该类碳源的微生物生长，从而对微生物群落结构和代谢特征产生影响^[29]。本研究中S处理土壤酸杆菌门相对丰度最高，这与郝近羽等^[30]研究结果一致，可能是由于施用生物质炭有机肥后能刺激酸杆菌门在土壤中降解顽固的有机物质的相关代谢活动^[31]，为酸杆菌门提供生长机会。前人研究表明，施肥处理后变形菌门相对丰度会显著升高^[32-33]，然而本试验结果表明变形菌门的相对丰度以CK处理最高，造成这一现象的原因可能是短期施肥培养条件未能为变形菌门提供适宜生长环境，后续有待进一步研究。此外，大多数与脱氮相关的功能菌(如氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌和反硝化菌等)都属于变形菌门^[34]，这可能是CK处理矿质氮含量低于其他处理的重要原因。通过BugBase表型预测发现，B处理好氧菌丰度显著增加，相反厌氧菌的丰度下降，而酸杆菌门宜在厌氧和微氧的环境中生存，施加芝麻饼肥后，酸杆菌门相对丰度下降，与厌氧菌变化趋势一致，说明添加芝麻饼肥可以提高土壤的氧化胁迫耐受能力。

根据不同有机肥氮素矿化的规律，在烟草种植过程中，可以选择在前期施用芝麻饼肥，可以满足烤烟苗期旺盛的养分需求；后期生物质炭有机肥追肥，但应控制施肥量，以满足烤烟不同时期的氮素需求。

4 结论

施用有机肥通过改变土壤微生物群落和氮素转化相关酶活性而提高了土壤矿质氮含量，促进氮素形态间的相互转化。但不同有机肥对功能微生物活动及相关酶活性影响有一定差异，进而造成土壤氮素矿化动态和不同时期的矿化速率和矿化量的不同。综合来看，施用芝麻饼肥有利于促进早期氮素矿化，提高矿化量；而生物质炭有机肥后期矿化量较大且矿化速率较快，土壤细菌多样性及丰富度也最高。在烟叶生产中，应根据不同有机肥施用对土壤氮素矿化的影响程度，科学调整烟田无机氮施用量，以实现氮素营养的精准供应。