土壤酸化是土壤退化的重要形式，表现为土壤pH下降^[1]。土壤酸化已成为当今国际社会最关注的生态环境问题之一^[2]。由于农业生产上不合理使用肥料，导致我国农业土壤出现大规模的酸化现象^[3]。据相关资料显示，连续施用化学氮肥10 ~ 20a，部分耕层土壤pH下降幅度可超过1个单位，且随施氮量的增加而pH明显降低^[4]。近年来苹果园土壤酸化现象非常严重，尤其以环渤海湾产区最为突出^[5]。

土壤酸化打破了原有的土壤生态平衡，导致土壤理化性质改变，土壤微生物数量、活性、多样性及种群结构发生改变，有机质含量降低，不利于植物的正常生长^[6]。Lawrence等^[7]研究发现酸沉降导致的土壤Al活化是北美森林土壤缺Ca的主要原因，因为土壤有效态Ca含量与土壤交换性Al呈显著的负相关关系。苹果园土壤酸化加速Ca、Mg盐基离子淋失导致果实苦痘病、痘斑病、水心病普遍发生^[8]。土壤pH下降也会影响土壤养分的有效性，使土壤中Cu、Mn、Pb等重金属元素浓度增加，活动性增强^[9]。果园重金属如Cu污染加剧，导致果树生长发育迟缓，植株矮小，主根生长不良，叶片叶绿素含量降低，光合速率下降，进而影响果树产量^[10]。由于酸化土壤很难通过自身作用恢复至正常的pH，而其中含有的重金属也难以在自然条件下降解或稳定化，因此能否采用有效的方法减轻或克服土壤酸化成为苹果产业可持续发展的一项重要工作。王桂华等^[11]研究表明，在酸性土壤上施用生石灰能明显提高土壤pH，显著促进苹果的生长。但也有研究发现生石灰施用过量会导致土壤板结，引发营养物质流失，从而导致作物减产^[12]。贾明等^[13]研究发现菌渣等农业废弃物还田可以提升土壤有机质和养分含量，增加团粒结构，降低土壤容重，改善土壤理化性质。Álvarez等^[14]研究发现，酸性、风沙性、泥炭土等土壤中施用贝壳粉后均能够使土壤pH上升，且土壤有机质、有效磷含量和土壤阳离子交换量均有所提高。也有研究表明，贝壳粉可以显著降低土壤中Cd的有效性，降低土壤Cd的酸可溶态含量，提高残渣态含量，同时可有效减少水稻各组织对Cd的吸收^[15-16]。但目前关于生石灰、贝壳粉与菌渣等有机物配合使用对苹果园酸化土壤改良鲜有报道。因此本课题组研发以生石灰、贝壳粉、菌渣等有机物为主要有效成分的两种改良剂，探讨两种改良剂对酸化苹果园土壤pH、重金属活性、病原镰孢菌数量、微生物群落结构、果实品质的影响，以期为酸化苹果园土壤改良提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料与处理

试验于2017年在山东烟台栖霞郭家埠头村、栖霞官地村、栖霞任留村、招远大户陈家村、莱州小草沟村、莱州大沙岭村、牟平官庄村、栖霞十里堡村、文登后村进行。

供试改良剂由烟台绿源有机肥有限公司和德州创迪微生物资源有限责任公司生产。烟台改良剂配方：羊粪400 g/kg、木薯渣300 g/kg、菌渣100 g/kg、糖渣100 g/kg、生石灰50 g/kg、贝壳粉(30目)30 g/kg、骨粉20 g/kg。德州改良剂配方：菌糠700 g/kg、蛋白泥120 g/kg、草木灰100 g/kg、生石灰50 g/kg、贝壳粉(30目)30 g/kg。2017年3月10日进行土壤处理，试验处理为不施用改良剂和施用改良剂。两种改良剂均采用定点施用方式，沿树行方向，中心干两侧，距中心干80 cm各开一沟(共两沟)，沟长80 cm，深30 cm，宽20 cm，每沟施用改良剂2.5 kg，土壤混匀后回填。对照处理不施用改良剂。每个处理苹果树20株。于2017年10月取样，进行各项试验指标的测定。

1.2 测定指标及方法

土壤有机质采用重铬酸钾容量法(稀释热法)测定；土壤pH采用酸度计测定(水土质量比1∶2.5)；土壤Cu、Mn、Ca含量采用DTPA浸提，原子吸收分光光度法(AA6300C，日本)测定。具体参照鲍士旦^[17]的方法。

果实品质测定：使用电子天平测定单果重，游标卡尺测定果形指数，采用糖度计(SW-592)检测可溶性固形物的含量。

植株Cu、Mn、Ca元素含量测定：称取1 g干燥枝条、叶片、果实，放入150 mL三角瓶中，加入浓HNO₃ 25 mL，摇匀，放置过夜；于电热板上约200 ℃加热30 min，冷却，加HNO₃ -HClO₄混合酸5 mL，继续加热至有白烟产生，说明消化已完全，内容物已全部溶解；继续加热蒸去大部分HNO₃和HClO₄，冷却后用热水洗入50 mL容量瓶中定容，过滤；采用原子吸收分光光度法(AA6300C，日本)测定。具体参照鲍士旦^[17]的方法。

土壤镰孢菌基因拷贝数测定：参照段亚楠等^[18]的方法，使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit提取土壤DNA，用CFX96TMThermal Cycler(Bio-Rad)测定。

土壤微生物群落结构测定：用真菌ITS区通用片段引物(ITS1-F和ITS4)进行扩增，用限制性内切酶Hha I对PCR产物酶切，将酶切产物送至生工生物工程(上海)股份公司进行测序，采用SPSS 19.0软件对测序结果进行真菌群落聚类分析和主成分分析^[19]。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2003进行计算，通过SPSS 19.0软件进行方差分析，采用T检验检测结果的差异显著性。

2 结果 2.1 两种改良剂对苹果果实品质的影响

由表 1可以看出，经过两种改良剂处理后，苹果单果重、果形指数、可溶性固形物均得到显著提升。经德州改良剂处理后，单果重平均提高39%，各试验点果形指数达到0.83以上，可溶性固形物也达到14% 以上。经烟台改良剂处理后，单果量也平均提高36%，果形指数达到0.82以上，可溶性固形物也达到13.5%以上。

2.2 两种改良剂对苹果苦痘病发病率的影响

由表 2可以看出，经过两种改良剂处理后，苦痘病发病率显著降低，德州改良剂效果好于烟台改良剂。经德州改良剂处理后，在栖霞十里堡和招远大户陈家未发生苦痘病，在文登后村发病率仅为0.97%；经烟台改良剂处理后，苦痘病发病率也显著降低。表明两种改良剂可有效补充土壤中流失的Ca²⁺，减轻苹果苦痘病的发生。

2.3 两种改良剂对土壤pH和有机质的影响

由表 3可以看出，经过两种改良剂处理后，土壤pH明显提高，平均提高1.70。其中，牟平官庄与栖霞郭家埠头提高最为显著，与未施改良剂相比分别提高了2.16、2.08；栖霞十里堡pH变化量较小，提高了1.28。表明两种改良剂均能有效提高土壤pH，改良土壤酸化。

经过两种改良剂处理后，各试验点土壤有机质含量均显著提升，德州改良剂平均提高9.00 g/kg，烟台配方肥平均提高7.50 g/kg。其中，莱州小草沟有机质含量提高最为显著，与未施改良剂相比提高了11.54 g/kg；栖霞官地有机质含量提高最低，与未施改良剂相比提高了5.70 g/kg。表明两种改良剂均可有效提高土壤有机质含量，改善土壤结构。

2.4 两种改良剂对土壤及苹果植株Ca元素含量的影响

由表 4可知，经过两种改良剂处理后，土壤交换性Ca含量均显著提高，其中德州改良剂处理效果较好，招远大户陈家土壤交换性Ca含量提高了453.39%；苹果植株Ca元素含量也显著提高，其中莱州小草沟枝条Ca元素含量提高了88.67%，莱州大沙岭植株叶片Ca元素含量提高了49.58%；果实Ca元素含量也显著提高，栖霞任留提高最高，提高了176.12%。表明两种改良剂均能显著提高土壤交换性Ca含量，缓解植株Ca元素的缺失。

2.5 两种改良剂对土壤及苹果植株Cu元素含量的影响

由表 5可知，经过两种改良剂处理后，土壤有效Cu含量均显著降低，其中栖霞官地最为显著，与未施改良剂相比降低了82.82%；苹果枝条中Cu元素含量也表现为显著降低，平均降低30%；而叶片、果实中Cu元素含量略微降低，但整体与对照未达到显著性差异。

2.6 两种改良剂对土壤及苹果植株Mn元素含量的影响

由表 6可以看出，经过两种改良剂处理后，土壤中有效Mn和苹果植株Mn元素含量均不同程度地下降，其中文登后村经德州改良剂处理后效果最为显著，土壤有效Mn含量下降47.34%，苹果植株叶片Mn元素含量下降7.30%，枝条Mn元素含量下降14.83%，果实Mn元素含量下降26.23%。表明两种改良剂均能改良土壤酸化，降低土壤中重金属离子活性，减轻重金属胁迫。

2.7 两种改良剂对土壤镰孢菌基因拷贝数的影响

由表 7可以看出，经两种改良剂处理后，各试验点土壤串珠镰孢菌和腐皮镰孢菌基因拷贝数均显著降低。德州改良剂效果较好，串珠镰孢菌、腐皮镰孢菌拷贝数平均降低80%。经烟台改良剂处理后招远大户陈家土壤串珠镰孢菌和腐皮镰孢菌基因拷贝数分别下降了16.90%、28.08%。

2.8 两种改良剂对土壤微生物群落结构的影响

根据T-RFLP图谱中OTU的数量、种类及丰度，分别计算两种改良剂处理下土壤真菌多样性指数(表 8)。经过两种改良剂处理后，土壤真菌各项指数均发生改变，其中烟台改良剂处理后土壤真菌各项指数变化量小于德州改良剂处理。与未施改良剂相比，真菌丰富度指数、多样性指数、均匀度指数均有所提高，而优势度指数表现为降低趋势。

根据主成分的提取原则，选取2个主成分进行分析(图 1)。结果显示，各试验点施改良剂处理与未施改良剂处理均成为相对独立的微生物群，表明两种改良剂可以显著改变土壤真菌群落结构。

3 讨论

土壤是植物生长的基础，良好的土壤环境可以促进植物生长。前人研究发现由于过量施用化肥以及有机肥和微量元素用量不足引起盐基离子淋失、土壤交换性H⁺增多，同时酸雨和大量酸性气体的排放等原因导致土壤pH逐渐减小，土壤酸化现象越来越明显^[20]。大量研究表明，配施有机肥可以培肥土壤，调节土壤pH^[21-22]。Xiao等^[23]研究发现酸性土壤施用适量生石灰后可显著提高土壤pH，改善土壤养分，促进植物生长。本研究发现改良剂的施用提高了土壤pH，这与前人的研究一致，可能是改良剂中的生石灰、贝壳粉含有碳酸盐、硅酸盐以及Ca的氧化物等多种物质，能有效中和土壤酸度。同时有研究表明，土壤施用生石灰会导致土壤肥力的下降^[24]，然而本研究发现施用改良剂后土壤有机质含量明显提高，一方面可能是改良剂的用量以及改良剂中的生石灰含量均较少，未对土壤产生副作用；另一方面可能是改良剂中含有大量有机物，弥补了生石灰对土壤有机质的降低^[25]。

土壤平衡的养分供应也是保证植物生长的必要条件。由于不合理的农艺管理会造成土壤养分失衡，使原来有利于作物生长的“肥沃土”变成不利于作物生长的“毒土”^[18]，如土壤中Mn、Cu等元素的有效性增加，而Ca、Mg等元素严重不足^[7-9]。前人研究发现，pH是影响土壤元素形态最为关键的环境因子之一，土壤pH的变化会引起重金属吸附解吸、溶解沉淀平衡的变化，因此调节pH在土壤重金属原位钝化修复过程中具有至关重要的作用^[26]。本研究发现改良剂的施用提高了土壤交换性Ca的含量，降低了有效Mn、有效Cu的含量，这与李明等^[27]的研究一致。这可能是改良剂中的生石灰、贝壳粉中和土壤的H⁺，进而释放出大量的Ca²⁺，同时随着土壤pH的提高，土壤Mn²⁺、Cu²⁺与OH^–结合变成沉淀，进而降低了土壤有效Mn、有效Cu的含量；也可能是改良剂施用提高了土壤有机物含量，有机物表面的羧基、羟基等官能团可以与重金属结合，从而降低土壤有效Mn、有效Cu的含量^[28]。

土壤微生物的多样性和组成在调控土壤健康方面起到关键作用，微生物多样性的提高有助于土壤生态系统的稳定^[29]。已有研究表明，微生物的变化与土壤pH大小存在着一定联系，即pH与土壤的部分细菌数量呈正相关，与真菌数量呈负相关^[30]。同时当土壤中存在较高浓度的重金属时会对土壤微生物产生显著的效应，改变微生物群落结构^[31]。Wang等^[32]通过对环渤海湾地区老龄苹果园土壤分析发现镰孢属真菌是主要的致病菌。乔鈜元等^[33]研究发现土壤酸化导致土壤中病原镰孢菌的数量增加。本研究发现，施用改良剂后可显著降低土壤病原镰孢菌的数量，增加真菌丰富度、多样性指数，降低真菌优势度指数，改变土壤真菌群落结构。这可能是因为改良剂中含有大量的生石灰，生石灰一方面可以调节土壤pH，增加土壤中某些有益微生物的数量^[34]；另一方面生石灰可以直接杀灭病原镰孢菌^[35]，进而改变微生物群落结构。也可能是因为配方有机肥中的贝壳粉可以调节微生物群落结构。赵晓红等^[36]研究发现土壤施用贝壳粉，显著提高了细菌的丰富度和多样性，增加了细菌总OTU数量。

果实品质一直是人们比较关注的问题，果农单方面追求高产大果，导致化肥施用量远远超过苹果树的需要，使土壤退化加剧，植株缺素症发生，如土壤中Ca元素流失造成苹果苦痘病发生，同时土壤重金属超标，对植株造成胁迫，果实品质严重下滑^[37]。如何提高果实品质成为产业中亟待解决的问题。柴有忠等^[38]研究发现施用土壤改良剂可以缓解葡萄园土壤酸化，提高果实品质。本研究发现，施用土壤改良剂能有效降低苹果树体内Mn和Cu元素含量，提高Ca元素含量。一方面可能是改良剂通过提高酸性土壤pH来降低土壤Mn和Cu的有效态含量，同时生石灰、贝壳粉可以为土壤提供大量的Ca，进而导致苹果树体Mn和Cu元素含量降低，Ca元素含量增加^[27]；另一方面可能是改良剂改善了土壤的整体环境，促进了苹果树生长，植株生长的稀释效应降低了苹果树体内Mn和Cu元素含量。同时本研究还发现，改良剂的施用提高了苹果单果重、果形指数和可溶性固形物，这可能与植株体内Mn和Cu元素含量降低，Ca元素含量增加有关。郭爱华等^[39]研究发现，重金属进入植物体后对细胞分裂会产生毒害作用。目前研究发现影响单果重和果形指数的主要原因是果实内的细胞个数^[40]。刘庆^[41]研究发现，植物的糖含量及糖代谢酶活性在低浓度Cu胁迫下升高，在高浓度Cu胁迫下降低。

4 结论

施用两种改良剂后可显著改善苹果果实品质，降低苦痘病的发病率，提高土壤pH、有机质含量，有效补充土壤中流失的Ca元素，降低Cu、Mn的有效态含量，降低病原镰孢菌的数量，优化真菌群落结构，有效缓解苹果园土壤酸化。