2024, Vol. 56
2. 农业农村部环境保护科研监测所, 天津 300191
土壤重金属污染是全球面临的重要环境问题。大气沉降、工农业以及采矿业等自然与人为活动使得大量重金属进入土壤[1-2]，其中土壤镉(Cd)和砷(As)的污染较为严重，且多以复合污染形式存在[3]。我国Cd的点位超标率为7.0%，As的点位超标率为2.7%[4]。Cd在环境中易迁移，通过食物链进入人体，导致“痛痛病”，威胁人体健康[5-6]。As通过根系进入作物组织，抑制作物生长，导致作物减产[7]。更重要的是，As会引起人体系统相关疾病，有致癌风险[8]。而Cd、As在土壤中呈现相反的活性，导致二者复合污染土壤的修复具有较大难度[3, 9]。因此，寻找协同修复Cd、As污染土壤的方法对农业环境健康与人类健康具有重要意义。
坡缕石为硅镁酸盐黏土矿物，在自然界中储量丰富，具有丰富的表面官能团，但其对Cd的固定效果不佳[10]。采用巯基改性的坡缕石对水中以及土壤中的Cd、Pb和Zn等重金属具有良好的固定效果[11-12]。Liang等[12]研究显示，巯基改性可显著提高坡缕石对Cd2+的吸附。然而，巯基改性的坡缕石对复合重金属污染土壤的钝化效果尚不清楚，尤其是对Cd-As复合污染土壤的钝化还鲜见报道。
农田土壤修复后对土壤生态功能的影响是评价其修复效果重要的参考。微生物是土壤中最活跃的组分，参与土壤物质循环，对土壤肥力、酶活性的提升，以及维持土壤生态功能等具有重要意义[13]。微生物丰度及多样性受重金属影响较大。一般来说，重金属污染会抑制微生物活动，降低微生物丰度与多样性[14]，从而影响土壤生态功能。因此，在巯基坡缕石修复Cd-As复合污染土壤的过程中，探究微生物多样性及群落结构的变化对土壤生态功能的影响具有重要意义。然而目前关于巯基坡缕石对土壤生态功能影响的报道较少。
基于此，本研究以土培试验为依托，通过添加不同剂量的巯基坡缕石，分析巯基坡缕石对土壤基本性质，Cd、As固定效果和土壤生态功能的影响，以为巯基坡缕石在土壤修复的广泛应用提供理论及数据支撑。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤为Cd-As复合污染土壤，采自绵竹市某工业园区附近农田(104°15′17″E，31°25′6″N)的表层(0 ~ 20 cm)，土壤类型为水稻土。将土壤在室温下自然风干，清除土壤中的石块和植物残体，并分别过2、0.149 mm的尼龙筛，备用。供试土壤基本理化性质为：pH 8.82，全磷0.6 g/kg，全钾11.58 g/kg，全氮1.3 g/kg，有机质20.59 g/kg，总砷64.07 mg/kg，总镉2.74 mg/kg。
供试修复材料为巯基坡缕石，利用高速剪切溶胶-凝胶法制得，由农业农村部环境保护科研监测所提供。巯基坡缕石的基本理化性质为：pH 7.68，总镉0.12 mg/kg，总铜6.99 mg/kg，总锌6.84 mg/kg，SiO2 644 g/kg，MgO 205 g/kg，Al2O3 104 g/kg，Na2O 15 g/kg，CaO 12 g/kg。巯基坡缕石表面负载巯基(–SH)[12, 15]。
1.2 试验设计试验设置3个处理：①CK：不添加巯基坡缕石；②OC1：添加1% (m/m)巯基坡缕石；③OC2：添加2% (m/m)巯基坡缕石。每个处理设置3次重复。具体操作如下：称取100 g过2 mm筛的风干污染土壤于500 mL培养瓶中，加入巯基坡缕石，混匀，随后加入蒸馏水至田间饱和持水量的60%，置于温室大棚中于自然光照条件下进行培养试验。每天采用称重法补充水分，培养135 d后采样。
培养结束后，取出约10 g土壤于离心管中在–80℃环境下保存，用于分析土壤微生物指标。剩余部分土壤风干后过100目和10目筛，于密封袋在室温下保存，用于土壤基本理化性质分析。
1.3 样品测定土壤pH采用电位法测定；阳离子交换量(CEC)采用乙酸铵交换法测定；土壤有机质(OM)采用重铬酸钾–浓硫酸外加热法测定；土壤全氮(TN)采用半微量凯氏法测定；土壤全磷(TP)和全钾(TK)采用HClO4-H2SO4消煮后分别用钼锑抗比色法和火焰光度计法测定；有效磷采用0.5 mol/L碳酸氢钠浸提–钼锑抗比色法测定；土壤Cd、As和Fe总量采用硝酸–氢氟酸–高氯酸进行消解，分别使用电感耦合等离子质谱仪(Nex ION 300x)、原子荧光仪(AFS2202E)和全谱仪(ICAP5110)测定。
Cd和As的毒性特性浸出(Toxicity Characteristic Leaching Procedure，TCLP)采用pH为2.64 ± 0.05的0.1 mol/L醋酸溶液，按照土液比(m∶V)1∶20浸提18 h，获得浸出液并调节pH至2，测定浸出液中Cd和As含量。有效态Cd和As分别用DTPA浸提剂和0.5 mol/L NaH2PO4浸提剂提取后测定。
土壤铁(Fe)形态采用分级提取法测定，分为5个形态：交换态、络合态、无定形态、结晶态、残渣态，分别采用1 mol/L MgCl2溶液(pH 7)、0.1 mol/L焦磷酸钠溶液(pH 10)、0.2 mol/L酸性草酸铵(包含0.2 mol/L草酸和0.2 mol/L草酸铵，pH 3.2)、DCB (Dithionite-citrate-bicarbonate)溶液、硝酸–氢氟酸–高氯酸进行提取。所提取溶液采用邻菲罗啉比色法测定Fe含量。
采用试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)进行土壤DNA提纯，并在Illumina MiSeq平台进行测序。微生物的高通量测序由美因健康科技(北京)有限公司完成。
1.4 数据处理使用Excel 2019和SPSS 26.0对试验数据进行整理与统计分析，使用单因素方差分析中的LSD检验法对数据进行显著性分析(P < 0.05)。用Origin 2021及Canoco 5作图。
2 结果与讨论 2.1 巯基坡缕石添加对土壤理化性质的影响添加巯基坡缕石显著降低了土壤pH，并显著提升了土壤有机质含量(表 1)。与CK相比，OC1与OC2处理下土壤pH分别降低了0.81、1.04个单位(P < 0.05)，这可能是由于巯基的添加使土壤中有机酸的含量增加，从而降低土壤pH[11]。土壤有机质作为土壤肥力与缓冲能力的重要指标，其含量对于土壤健康具有重要意义[16]。土壤培养后，与培养前相比，CK处理下土壤有机质下降了42.1%，而与CK相比，OC1和OC2处理下土壤有机质分别增加了30.2%、60.9% (P < 0.05)。巯基坡缕石主要成分为无机矿物，添加巯基坡缕石不会直接增加土壤有机质含量，土壤有机质含量的变化可能是由于坡缕石改性后，巯基包裹着坡缕石，增加团粒结构，包裹了更多的有机物质，减少了有机质与微生物的接触，从而降低了有机质的消耗[17]。这表明添加巯基坡缕石有利于保持土壤肥力与缓冲能力。此外，Zhao等[18]研究发现，相较于其他含硫物质如Na2SO4和硫单质，巯基可显著提高土壤溶解性有机碳，这也解释了添加巯基坡缕石后有机质显著提高的现象。
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表 1 不同处理下土壤理化性质变化 Table 1 Soil physiochemical properties under different treatments |
对于农田土壤，土壤中重金属有效性直接影响农产品中重金属含量，通常采用DTPA浸提测定重金属生物有效性。同时对于重金属污染土壤，TCLP量是其修复效果的重要指标。如图 1所示，与CK相比，添加巯基坡缕石后，土壤DTPA-Cd与TCLP-Cd含量均显著降低，分别降低了97.7% ~ 98.3% 和77.1% ~ 92.7%(P < 0.05)，表明巯基坡缕石对Cd具有较好的固定效果。这一结果与Wang等[19]的研究结果一致。相比热改性坡缕石[10]、酸活化坡缕石[20]，本研究的巯基坡缕石对Cd有效性抑制效果具有明显的优势(表 2)。
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(图中不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05)) 图 1 不同处理下Cd(A)和As(B)的有效态含量变化及铁形态差异(C) Fig. 1 Concentrations of available Cd (A) and As (B) and iron fractions (C) under different treatments |
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表 2 不同稳定剂对镉污染土壤修复效果比较 Table 2 Remediation effects of different stabilizers on cadmium-contaminated soil |
通常情况下，土壤金属阳离子有效态含量与土壤pH、CEC呈负相关性[15]，但本研究中，土壤CEC无显著变化，pH显著降低(表 1)，而Cd有效性显著降低，这说明坡缕石不是通过调节土壤pH和CEC来降低Cd有效性。Cd有效性显著降低可能是因为Cd2+为软酸类金属离子，其对含硫(S)配体具有亲和性[12]。本研究所用的巯基坡缕石硫的含量为2.72 mmol/g，巯基坡缕石表面所负载的巯基易与Cd2+发生配位络合反应，从而使Cd2+转变为更稳定的状态[22]。此外，土壤有机质是影响重金属有效性的重要因素，重金属通过与有机质中的羧基和羟基等含氧官能团发生吸附络合等作用[21]，从而固定于有机质表面。本研究中，添加巯基坡缕石显著减少了土壤有机质的消耗，从而保存了更多土壤有机质中的官能团与较为活泼的组分含量，有利于土壤对Cd的吸附。
土壤中As的有效性受土壤氧化还原条件、共存离子和Fe形态等影响。As是一种多价态元素，在还原条件下，As(Ⅴ)被还原为As(Ⅲ)，其有效性与毒性均大幅增加。此外，由于磷酸根与砷酸根性质类似，会竞争砷酸根与土壤的吸附点位。Fathi-Gerdelidani等[23]研究发现，在向土壤添加磷酸盐后，即使在氧化环境下，As的释放量仍然有所提高。此外，土壤中As与Fe具有显著的相关性，As通常以As(Ⅴ)的形式固定于Fe矿物中，当处于淹水环境时Fe(Ⅲ)(氢)氧化物发生还原溶解，使吸附固定的As释放到环境中还原，溶解性与移动性提高[24]。本研究中，巯基坡缕石的添加未显著改变As有效性，主要是因为有机黏土本身含有大量带负电荷的胶体，其添加对以阴离子形式存在的As的有效性无显著影响[25]。同时，本研究中土壤含水量为田间持水量的60%，土壤呈现氧化环境，不利于As的还原溶解。此外，由图 1和表 1可知，巯基坡缕石的添加，并未使土壤中Fe形态与有效磷的含量发生显著变化，这表明土壤Fe矿物并未发生明显变化，且土壤中磷酸根无显著差异，因此对As的有效性无显著影响。综上，添加巯基坡缕石对土壤As有效性无显著影响。
2.3 巯基坡缕石添加对土壤微生物的影响 2.3.1 对微生物多样性与丰度的影响土壤微生物多样性与土壤生态系统的功能多样性呈正相关关系[13]，因此土壤微生物多样性对于评价土壤健康至关重要。本研究中，添加巯基坡缕石后，土壤OTUs(表 3)有所提高，但并未呈现显著差异，这表明添加有机黏土有利于土壤微生物丰度的增加，但这种增加的作用有限，Chao1指数的变化同样也说明这一点。Shannon指数与Simpson指数表示微生物多样性高低，其数值越大，微生物多样性越好。由表 3可得，1% 巯基坡缕石处理下Shannon指数和Simpson指数有所增加，但未出现显著差异。Li等[11]将巯基坡缕石添加进Cd污染土壤后，也发现各指标数值差异不大，对细菌群落多样性影响较小。
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表 3 不同处理下微生物多样性指数 Table 3 Microbial diversity indexes under different treatments |
为了进一步分析巯基坡缕石对土壤生态的影响，探讨了不同处理下门水平和属水平下细菌丰度的变化。图 2A显示，变形菌门(Proteobacteria)(28.0% ~ 52.5%)、厚壁菌门(Firmicutes)(15.8% ~ 30.0%)、放线菌门(Actinobacteriota)(10.3% ~ 13.5%)为各处理下土壤的优势菌门，这与其对重金属具有较强的耐受能力有关[26]。变形菌门广泛存在于Cd污染土壤中，Wang等[19]在碱性Cd污染土壤中发现变形菌门占28.9% ~ 30.8%；Li等[11]用巯基坡缕石修复土壤Cd污染时，变形菌门占38.1% ~ 41.8%。此外，变形菌门、厚壁菌门和放线菌门除耐受Cd之外，还是耐砷细菌[26]。本研究土壤为Cd-As复合污染土壤，因此耐砷的变形菌门、厚壁菌门和放线菌门微生物的丰度较高。与CK相比，变形菌门相对丰度在OC2处理下提高了53.4%(P < 0.05)，这可能与硫循环密切相关。硫循环过程离不开硫代谢菌的参与，如硫杆菌可氧化土壤中的硫，而硫代谢菌属于变形菌门[19, 27]。添加巯基坡缕石会引入大量巯基，在促进硫循环的同时也会刺激硫代谢菌生长，从而提高变形菌门丰度。
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图 2 不同处理下门水平(A)和属水平(B)的土壤微生物群落组成 Fig. 2 Soil microbial community compositions at phylum (A) and genus (B) levels under different treatments |
值得注意的是，添加巯基坡缕石后蓝藻细菌门(Cyanobacteria)在OC1和OC2处理下相对丰度分别降低了73.0% 和94.3%(P < 0.05)。蓝藻为光自养微生物，在众多环境中被发现，包括重金属污染区域[28]。如Anjana等[29]从纺织厂重金属污染土壤中分离出钙质氮球菌和衣球菌两种蓝藻菌，并用于Cr(Ⅵ)的吸附。同时，重金属除会对微生物产生毒害外，一些重金属如Cu、Zn、Mn等是微生物生长过程中必要的微量元素[28]，对微生物生长代谢至关重要。添加巯基坡缕石后，不仅会固定Cd，还会吸附环境中的Cu[30]等微量元素，这可能抑制蓝藻的生长。
除门水平外，各处理间细菌属水平下也具有显著差异。图 2B显示，假鱼腥蓝细菌属(Pseudanabaena_NgrPSln22)(0.22% ~ 11.6%)、芽孢杆菌属(Bacillus) (6.17% ~ 9.18%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas) (3.93% ~ 8.73%)、假单胞菌属(Pseudomonas)(1.22% ~ 5.79%)、溶杆菌属(Lysobacter)(4.26% ~ 21.38%)为各处理下土壤优势细菌。与CK相比，OC1、OC2处理下假鱼腥蓝细菌属相对丰度显著降低，分别降低了85.4% 和98.1%(P < 0.05)，这主要是因为假鱼腥蓝细菌属适合在偏碱性环境下生存，而巯基坡缕石处理下土壤pH为7.78 ~ 8.10(表 1)，不利于其生长，从而导致其相对丰度下降[31]。假单胞菌属对众多污染物，如重金属、抗生素和无机化合物等具有较好的耐受性[32]。本研究中，与CK相比，OC1、OC2处理下假单胞菌属相对丰度分别下降了78.9%、75.3%(P < 0.05)，这是由于假单胞菌属对pH敏感，适合在较高的pH下存活[32]。本研究中，随着巯基坡缕石的增加，土壤pH逐渐降低，不利于假单胞菌生长。此外，与CK相比，OC2处理下溶杆菌属丰度提高了312%(P < 0.05)，这是由于添加巯基坡缕石后土壤有机质含量显著提高，而有机质含量高的环境有利于溶杆菌生长[33]。
综上，巯基坡缕石会显著改变土壤细菌优势菌群，影响土壤生态功能，如蓝藻细菌门中分布着大量固氮菌，固氮菌可以提高土壤中氮化合物含量，尤其是无机氮。本研究中的假鱼腥蓝细菌属为固氮菌属，巯基坡缕石添加后，其相对丰度显著降低，可能削弱土壤氮循环[34]。此外，溶杆菌与假单胞菌可与病原微生物竞争营养物质，同时分泌可抑制植物病害的代谢物，起到防治作物病害的作用[35]，对维护农田土壤健康至关重要。本研究中，溶杆菌属相对丰度显著增加，而假单胞菌相对丰度显著降低，二者的相反变化对土壤健康的影响还需进一步研究验证。
2.3.3 环境因子与微生物群落结构的相关性为了进一步明确环境因子与土壤微生物群落的关系，对门水平的主要细菌与土壤理化因子进行Pearson相关性分析(图 3)，结果显示，pH和Cd的有效性是影响微生物群落的重要因素。与大数研究相同，本研究中pH为影响微生物的显著因素，这是由于pH能引起土壤重金属有效性、有机质腐殖化和土壤酶活性等的变化[32]。同时，pH是微生物生长的限制因素，如本研究中的蓝藻细菌门更偏好碱性环境，巯基坡缕石的添加降低了土壤pH，使蓝藻生长环境恶化，相对丰度降低，与Rangsayatorn等[31]的研究一致。本研究中的蓝藻细菌门与放线菌门丰度和Cd的有效性呈显著负相关，这是由于其通过特殊的代谢能力减少重金属对自身的毒性[27]。此外，添加巯基坡缕石后，Cd的有效性降低，Cd对粘球菌门(Myxococcota)的毒性降低，因此粘球菌门丰度升高。然而，有机质对微生物群落的影响并没有产生显著影响，与前人研究不一致。这可能是由于巯基坡缕石引起的pH与Cd的有效性变化对微生物群落影响强于有机质的影响，这说明巯基坡缕石通过显著改变土壤pH与Cd的有效性对微生物群落产生影响。
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(网格中的星号表示Pearson相关性的显著性水平：**P < 0.01，*P < 0.05) 图 3 环境因子与微生物群落的Pearson相关性 Fig. 3 Pearson correlations between microbial community and environmental parameters |
巯基坡缕石可显著降低Cd-As污染土壤中Cd的有效性，其中2% 巯基坡缕石处理效果更佳。添加巯基坡缕石可显著降低土壤pH，提高土壤有机质含量，表明巯基坡缕石可改善土壤质量。添加巯基坡缕石后，土壤微生物群落结构显著改变，土壤固氮菌丰度显著降低，抗病菌丰度显著增加，其中pH和Cd的有效性是影响微生物群落结构的主要因素。
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