磷石膏是湿法生产磷酸时产生的工业固体副产物，每生产1 t磷酸就会产生4 ~ 5 t的磷石膏^[1]。磷石膏的主要成分为CaSO₄·2H₂O，含有钙、镁、氟等磷酸盐和硅酸盐，还有少量的重金属和放射性物质^[2]。在全球范围内，大量堆存的磷石膏不仅占用了农田和林地，影响土地资源的利用，还引起了严重的环境污染问题。磷石膏中残存有酸性物质、重金属和放射性元素，产生的酸性渗滤液可能会渗入地下水和土壤，引起土壤酸化和水体污染^[3]。近年来，磷石膏的利用取得了一定进展，如作为建筑材料，具有一定的市场需求；作为土壤改良剂，能够改善土壤结构，增加土壤的透气性和保水性；作为水泥生产中的缓凝剂，可以调节水泥的凝结时间，改善水泥的性能^[4]。整体来说，磷石膏的利用现状正在逐步改善，资源化利用途径逐渐拓宽。而目前磷石膏农用研究方面仍然面临很多问题，如钙磷营养元素未得到充分利用，化学处理方法存在二次污染等。因此，开展磷石膏资源高值利用研究，具有重要的理论和实际意义^[5]。

施用土壤调理剂是一种改良盐碱性土壤的有效措施。它通过调节土壤酸碱度，改善土壤理化性质来促进作物对水分和养分元素的吸收，从而促进作物的生长^[6-7]。国内外对土壤改良剂的研发和使用日益增加，针对不同土壤类型，已开发出多种类型的改良剂，例如，以石灰、磷酸钙、硫酸铁等为原料制备的矿物土壤改良剂，能够调节土壤酸碱度，提供植物所需的营养元素^[8-9]；以微生物制剂为原料制备的生物土壤改良剂，能够增加土壤微生物活性，促进有益微生物生长^[10]；以石膏、沙子、粉煤灰等为原料制备的物理土壤改良剂，能够改善土壤质地，增加土壤通气性和排水性^[11]。

基于以上，本研究以商品化土壤改良剂和磷石膏为基质，拟采用半固体发酵法和氨水矿化CO₂技术，改性商品化土壤改良剂，制备磷石膏土壤改良剂。且为提高产品品质和降低生产成本，拟通过单因素试验、Plackett-Burman试验和基于响应面分析法的中心组合设计(Central composite design，CCD)探究影响发酵工艺的显著性因素并预测最优发酵条件，优化半固体发酵工艺，以为磷石膏资源化利用提供新的途径，为土壤改良和地力提升提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试磷石膏取自安徽省宁国市司尔特肥业股份有限公司，其主要成分为CaSO₄ 76%、磷0.64%，含水率18%，pH 5.8。市售土壤改良剂购买自沃农肥业有限公司，主要成分为复合菌、有机硅和菜粕，有效活菌数≥2×10¹⁰ cfu/g，含水率≤10%。

供试土壤样品采自司尔特肥业股份有限公司的磷石膏长期贮存地，堆放时间25年以上。土壤样品于2023年3月采集，采用5点采样法采集0~10 cm土样，混合均匀去除石块和根茎等杂质后，留取土壤样品约5 kg，置于–20℃冰箱保存。

供试菌株XP61、XP81和XP10，为溶磷菌，由本试验筛选，用于进行发酵试验。溶磷菌能够将磷石膏中难溶的Ca₃(PO₄)₂转变成植物可以利用的可溶性磷酸盐，进而增加磷石膏土壤改良剂中可溶性磷含量。菌株保藏于南京农业大学环境微生物实验室，命名为Bacillus sp. XP61，Enterobacter sp. XP81，Bacillus sp. XP10。

蒙金娜无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10 g，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，Ca₃(PO₄)₂ 5 g，MnSO₄·7H₂O 0.03 g，琼脂15 g，pH自然，118℃灭菌30 min，用于筛选溶磷菌。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，用于纯化和接种溶磷菌。

1.2 溶磷菌的筛选

采用钼锑抗比色法筛选具有高效溶磷能力的菌株。首先，取10 g供试土壤样品加入100 mL的三角瓶中，再加入40 mL蒙金娜无机磷液体培养基富集培养7 d；采用稀释平板涂布法，对土壤富集液进行梯度稀释至10^-5，吸取100 µL稀释液涂布于蒙金娜无机磷固体培养基上，在30 ℃培养箱中培养7 d；挑取产生明显透明圈的菌落，划线纯化3 ~ 6代，直至培养皿上长出单菌落。然后，将单菌落接种于LB液体培养基中培养至指数生长期(约1×10⁸ cfu/mL)，吸取100 µL菌悬液加入5 mL蒙金娜无机磷液体培养基中。同时设置不接菌悬液的对照组，每组设3个重复。在恒温振荡摇床上连续培养3、7和11 d后，各取2 mL菌液，在10 000 r/min的离心机上离心10 min，去除菌体，吸取0.5 mL上清液，采用钼锑抗比色法测定样品的OD₇₀₀值，并根据磷标准曲线计算各菌液中的磷含量，减去对照组中的磷含量，即可得到不同培养时期菌株的溶磷量。

1.3 溶磷菌种子液的制备及发酵体系的构建

向250 mL锥形瓶中加入100 mL蒙金娜无机磷液体培养基，灭菌后将活化的溶磷菌转接到液体培养基中；将培养基置于30℃、180 r/min摇床中培养24 h，吸取菌液并划线培养获取单菌落；挑取单菌落转移至100 mL LB液体培养基中，恒温培养16 h制成种子液，用于菌种发酵培养^[12]。

称取碾磨过筛后的市售土壤改良剂27 g和磷石膏3 g作为磷石膏土壤改良剂发酵基质，装入250 mL锥形瓶中，再按试验设定比例添加溶磷菌种子液和无菌水，搅拌均匀，并在试验设定的条件下静置发酵。

1.4 试验方法

单因素试验：为探究料水比、初始pH、发酵温度、发酵时间和接种量5个因素对磷石膏土壤改良剂发酵进程中磷含量的影响，每个因素设置5个水平进行试验。其中，料水比设置为3、4、5、6、7，初始pH设置为5、6、7、8、9，发酵温度设置为30、37.5、45、52.5、60 ℃，发酵时间设置为5、6、7、8、9 d，接种量设置为0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%。单因素试验过程中，其他因素采用中值，每组试验设置3次重复。

Plackett-Burman试验：Plackett-Burman试验是针对多因子对于因变量显著性影响的筛选试验，主要通过比较各因子高低水平对响应变量的影响差异来区分各因子的显著性^[13]。本研究采用Plackett-Burman试验分析发酵因素对发酵液中溶磷量的影响。上述5个影响因子分别取高(1)和低(–1)2个水平进行优化，以溶磷量作为单一响应值，确定对溶磷量影响显著的因素。利用Minitab 17软件构建了12组试验处理，每组设置3个重复，各因素的高低水平如下：料水比为1∶4、1∶6；初始pH为7、9；发酵温度为45、60 ℃；发酵时间为6、8 d；接种量为0.5%、1%。

CCD试验：CCD试验是指基于响应面分析方法的中心组合设计试验。本研究使用Design-Expert 13软件设计CCD试验，分析Plackett-Burman试验获得的显著影响因素之间的交互关系对发酵液中溶磷量的影响，以获得最优的发酵参数。CCD试验中选取显著影响因素的低(–1)、中(0)、高(1)3个水平，共13组处理进行试验，每组设置3个重复，各因素水平设置如下：初始pH为7、8、9；发酵温度为45、52.5、60 ℃。

氨水矿化CO₂试验：由于磷石膏中主体成分为硫酸钙，通过氨水矿化CO₂反应，可将磷石膏中的硫酸钙转化成可溶性的硫酸铵^[14]，进而去除硫酸钙，提高土壤改良剂中硫酸根离子含量。将Plackett- Burman试验后的最优发酵产物转入可密封的西林瓶中，加入一定量的氨水，并通入CO₂气体，探究氮硫比、反应温度及反应时间对硫酸钙分解的影响。其中，氮硫比设置为2、2.5、3、3.5，反应温度设置为25、30、35、40 ℃，反应时间设置为2、3、4和5 h。

发酵产物提取和测定：发酵结束后，将氨水矿化CO₂反应后的发酵产物置于150 r/min摇床中，常温下提取30 min；随后吸取2 mL发酵液转入离心管中，在转速12 000 r/min下离心10 min，将上清液转入干净的离心管中。采用钼锑抗比色法测定上清液中磷含量^[15]，即为磷石膏土壤改良剂中可溶性磷含量，并采用铬酸钡还原法测定上清液中硫含量^[16]。根据测得的发酵液中的磷含量，计算得到发酵工艺后培养基中可溶性磷含量，减去磷石膏初始可溶性磷含量(25.5 ± 1.3) mg/L，即得到发酵工艺后培养基中可溶性磷的净增加量。

磷石膏土壤改良剂其他理化参数测定：pH测定参考土壤pH测定方法；可溶性氟采用选择性电极法测定^[17]；含水率采用烘干法测定。

1.5 数据处理与统计分析

试验数据采用SPSS 26软件进行单因素方差分析，结合Duncan、LSD等方法进行多重比较，并以P < 0.05作为具有显著性差异的判断标准。

2 结果与分析 2.1 溶磷菌溶磷效果

本研究通过钼锑抗比色法测定，筛选得到10株溶磷菌(图 1A)。其中溶磷量较高的5株菌，分别命名为XP61、XP62、XP81、XP82和XP10。菌株XP61第11天溶磷量最高，为85.57 mg/L；菌株XP62第11天溶磷量最高，为57.95 mg/L；菌株XP81第7天溶磷量最高，为103.34 mg/L；菌株XP82第3天溶磷量最高，为89.07 mg/L；菌株XP10第7天溶磷量最高，为64.22 mg/L将挑选的5株菌株进行混合溶磷，溶磷菌XP61、XP62、XP81、XP82和XP10各自编号为1、2、3、4和5，测定任意3株溶磷菌混菌后的溶磷量，结果如图 1B所示。可见，135组合在第9天时溶磷量最高，为201.2 mg/L，因此，选择菌株XP61、XP81和XP10进行后续发酵试验。

2.2 磷石膏土壤改良剂发酵单因素试验结果

设置不同的试验因子和因子水平，测定不同因素下磷石膏改良剂发酵液中的溶磷量，结果见表 1。不同因子水平下，发酵液中溶磷量存在显著差异，优化前反应体系中溶磷量为38.05 mg/L，优化后反应体系中最高溶磷量为144.32 mg/L，是优化前的3.79倍。不同初始pH和温度处理下，反应体系中溶磷量差异显著，最高溶磷量分别是最低溶磷量的1.54倍和3.68倍，而其他试验因子不同水平下溶磷量差异不显著。

2.3 Plackett-Burman试验结果

Plackett-Burman试验设计表和试验结果见表 2。不同参数组合下发酵液中溶磷量差异明显，其中第4组处理下溶磷量最高，为135.93 mg/L。根据试验结果和回归系数表绘制标准化效应的Pareto图(图 2)，可以更加直观地观察到不同因素对发酵的影响程度。由图 2可知，各因素对于半固体发酵的影响程度为：C > B > E > A > D，P值分别为0.009、0.034、0.184、0.361和0.615，其中初始pH(B)和温度(C)的P < 0.05，表明初始pH和温度是磷石膏土壤改良剂发酵的显著影响因素，后续将选取这2个因素进一步优化。

2.4 CCD试验结果

通过Design-Expert 13软件设计CCD试验(表 3)。对试验数据进行拟合分析，获得溶磷量和显著影响因素之间的多元二次回归方程：溶磷量=142.37+3.89B– 1.58C+2.83BC–35.01B²–30.69C²。方差分析结果表明(表 4)，该模型的P < 0.01，模型因变量与各因素之间关系显著，所建模型可靠，可以用该模型分析和预测发酵液中最大溶磷量。

响应面曲线的3D效果图见图 3。该图显示了显著影响因子之间的交互作用对磷石膏土壤改良剂半固体发酵的影响，同时也预测了显著影响因子是否存在最佳值。该模型预测的最佳发酵条件：温度52.33 ℃、初始pH 8.05，理论最大溶磷量为142.50 mg/L。为验证模型预测的溶磷量与实际溶磷量的拟合程度，以优化后的工艺参数进行3次重复试验，试验测得的最大溶磷量为143.71 mg/L与理论值接近，表明此模型有效。

2.5 氨水矿化CO₂反应结果

采用铬酸钡还原法测定氨水矿化反应后磷石膏土壤改良剂发酵液中硫酸根离子浓度，结果如图 4所示。当氮硫比为3，反应4 h后，硫酸根离子浓度达到最高。方差分析表明，氮硫比为3和3.5处理与氮硫比为2和2.5处理之间存在显著差异，反应4 h和5 h处理下硫酸根离子浓度显著高于其他处理组。在不同的反应温度下，硫酸根离子浓度也存在差异，在35℃下反应4 h后，硫酸根离子浓度达12.67 g/L，此时磷石膏的转化率为50.02%，继续提高反应温度，发酵液中硫酸根离子浓度降低。因此，确定最适反应时间为4 h，最适反应温度为35℃。

2.6 磷石膏土壤改良剂养分参数

在最优发酵参数料水比1∶5、pH 8.05、温度52.33℃、溶磷菌接种量0.75% 和培养时间7 d条件下，采用氨水矿化CO₂反应处理发酵产物，在氮硫比3、反应温度35℃和反应时间4 h条件下，最终获得的发酵产物属性见表 5。其中，可溶性磷含量为718.5 mg/kg，可溶性硫含量为63.33 g/kg，可溶性氟质量分数小于0.18%，含水率为18.4%，pH为6.2。

3 讨论

溶磷菌通过分泌有机酸或磷酸酶的方式转化磷石膏中难溶性磷，进而提高反应体系中的可溶性磷含量。杨美英等^[18]对筛选到的溶磷菌的溶磷机制研究发现，菌株WJ1、WJ3和WJ6可通过生成次级代谢产物α-酮戊二酸来转化难溶性磷酸盐。Karim等^[19]从富营养化水体中筛选到两株溶磷菌，发现菌株LW-17和9410-O通过磷酸酶作用来分解无机磷，进而提高水中可溶性磷含量。本研究中的溶磷菌与Karim等^[19]的菌株为同一属，推测该溶磷菌也可能是通过分泌磷酸酶的方式转化难溶性磷。其主要机理是：溶磷菌分泌磷酸酶，磷酸酶作用于Ca₃(PO₄)₂等难溶性磷酸盐，断裂钙离子与磷酸根离子之间的离子键，进而释放可溶性磷^[20-21]。此外，溶磷菌的溶磷量越高，其溶磷能力越强。苏辉兰等^[22]分离筛选出可以将难溶性磷转化成可溶性磷的菌株W3，溶磷量达148.57 mg/L。本研究中，溶磷菌XP61、XP81和XP10的单菌溶磷量分别为85.57、103.34和64.22 mg/L，通过混菌正交优化后，3株溶磷菌的混合溶磷量达221.32 mg/L，显著高于单菌溶磷量。由于不同菌株作用效果存在差异，混菌之间互利协同作用使酶系比例协调，同时提高了酶量，使得混菌发酵的溶磷能力得到提升^[23]。

固体发酵过程中，料水比、初始pH、发酵时间、发酵温度和混菌比例等因素对发酵产物的产量和品质影响很大^[24]。本试验发现，发酵温度和初始pH是磷石膏土壤改良剂发酵过程中的显著影响因素，选择合适的发酵温度和初始pH是提高发酵效率的关键^[25]。本研究中，溶磷量随发酵温度变化呈现先增高后降低的趋势，这可能是因为发酵温度的变化会影响微生物自身的生长，并且微生物中多数的化学反应是在酶的催化下完成的，不同的酶均有最适的温度，温度的变化会抑制菌体的生长，减缓酶促反应速率，影响代谢产物的合成^[26]。pH的变化不仅会影响酶的活性，还会改变微生物细胞膜所带电荷的状态，进而改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的释放^[27]。而其他发酵因子如料水比、发酵时间和溶磷菌接种量等，并不是发酵过程中影响溶磷量的显著因素。发酵基质中含水量过高会影响物料的溶氧能力和松散性，加快发酵热量的散失；含水量过低则会降低物料的溶解量，影响养分的传递和微生物对基质的利用效率^[28]。此外，虽然较低的菌体接种量会延长物料的发酵时间，但是随着发酵时间的延长，在发酵体系中最终会达到一个稳定的、最大的微生物量^[29]。

磷石膏的主要成分为二水硫酸钙，在水中的溶解度很低，仅为1.8 g/L。采用氨水矿化CO₂技术可将硫酸钙碳酸化，可提高磷石膏土壤改良剂中可溶性硫含量。本研究从对磷石膏转化效率影响较大的因子进行优化，获得了较高的可溶性硫酸盐含量。根据化学反应式，理论上氮硫比为2时，硫酸钙可被全部转化，但由于氨水本身易挥发，且发酵基质中其他成分可能会吸收部分氨水，导致当氮硫比为2时，硫酸钙不能完全反应，需要适当增加氨水的用量；而过高浓度的氨水会增加溶液黏度，NH₄⁺吸附在磷石膏表面反而会抑制硫酸钙的溶解^[30]。因此，优化试验参数后，在氮硫比为3处理下，溶液中可溶性硫酸根离子浓度最高。此外，过高的反应温度同样会加快氨水挥发，导致磷石膏不能充分反应。与黄岩等^[31]的研究结果相比，本研究虽然未考虑CO₂浓度对试验结果的影响，但在试验中持续通入了足量的CO₂，增加了CO₂在液相中的停留时间，使其与磷石膏基质充分反应，确保了磷石膏能够达到最大转化率。Lee等^[32]对磷石膏矿化反应参数进行优化发现，在加压条件下磷石膏在10 min内转化率可达95% 以上。增加压力可以增大CO₂与磷石膏接触反应几率，提高转化率，但加压后容易引起细胞膜破裂，致使发酵细菌原生质外渗而引起细胞死亡^[33]。本研究为保证土壤改良剂中细菌的数量和活性，未对矿化反应进行加压。而在常压条件下，部分碳酸钙遇到溶有CO₂的水会转化为可溶性的碳酸氢钙，导致滤液中的Ca²⁺物质的量增多，抑制硫酸钙转化率^[34-35]，这也是导致本研究中磷石膏转化率较低的原因。经过各单因素试验优化后，本试验中磷石膏转化率为50.02%，即1 t磷石膏理论上可以吸收固定106.22 kg CO₂，这可能是农田土壤固碳增汇良好的后备材料。

4 结论

本研究以市售土壤改良剂和磷石膏为原料，采用半固体发酵工艺制备磷石膏土壤改良剂，在单因素试验获得较优发酵参数的基础上，利用Plackett- Burman试验筛选得到具有显著性影响的发酵因素为初始pH和温度，进一步利用CCD试验获得显著影响因素和可溶性磷含量之间的回归方程，绘制响应面曲线，得到最佳发酵参数组合：发酵温度52.33 ℃、初始pH 8.05，该条件下可溶性磷含量为142.50 mg/L。在氮硫比3、反应温度35 ℃和反应时间4 h条件下，磷石膏土壤改良剂与氨水和CO₂反应后，可溶性硫含量为12.67 g/L，可固定106.22 kg CO₂。总体上，本研究制备的土壤改良剂，可以有效调节土壤pH、增加可溶性磷酸盐和硫酸盐含量，进而提高土壤固碳增汇能力，对土壤改良和地力提升具有重要意义。