2026, Vol. 58
2. 浙江省耕地质量与肥料管理总站, 杭州 310020
磷参与调控植物体内物质能量代谢及生长发育等过程，是植物的重要养分之一[1]。然而，全球约43% 的耕地土壤面临有效磷匮乏问题[2]。且磷易被铁铝氧化物固定或形成难溶性磷酸盐，导致生物有效性显著降低[3-4]。土壤无机磷作为土壤磷库的关键组分之一，约占全磷的60%~80%，因此提高土壤无机磷的活化与有效性是目前提高作物磷利用效率的主要研究热点[5-7]。
土壤解磷微生物在土壤磷循环中发挥着关键作用[8]。其中携带pqqC基因的解磷微生物是土壤磷活化的关键驱动者，其可通过分泌有机酸(如草酸、柠檬酸)和质子，溶解土壤难溶性磷化合物以提高土壤有效磷含量[9]。如pqqC基因编码PQQ合成途径中的关键酶，能够通过增强PQQ的合成，提高葡萄糖脱氢酶(GDH)的活性，进而催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，溶解矿物磷，提高土壤磷的可用性[10]。尽管前人已经证明了pqqC基因丰度在长期施肥条件下会显著增加[11-12]。但在缺磷条件下，水稻根际土壤携带pqqC解磷微生物的功能基因表达动态、群落结构演替规律和对根际土壤无机磷组分的影响仍不清楚。因此，探究长期缺磷条件下，水稻根际携带pqqC基因的解磷微生物响应缺磷胁迫的机制，对挖掘高效溶磷微生物资源、开发微生物肥料和促进农业可持续发展具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验于中国水稻研究所(浙江富阳)温室大棚进行，供试水稻品种为日本晴。供试土壤基础理化性质为pH 6.35，有机质11.77 g/kg，全氮0.75 g/kg，有效磷6.07 mg/kg。试验设置不加磷(–P)与加磷(+P)盆栽处理。盆栽每盆装土4 kg，种植一穴水稻，每个处理6个生物学重复。试验氮肥折合大田施用量为180 kg/hm2(以N计)，按5∶3∶2比例分别作为基肥、分蘖肥和穗肥施加；加磷处理(+P)下磷肥折合大田施用量为40 kg/hm2(以P2O5计)，作为基肥一次性施加；钾肥折合大田施用量为160 kg/hm2(以K2O计)，按1∶1比例作为基肥和穗肥施加。试验连续处理5年，在第5年水稻成熟期收集根际土壤用于土壤微生物特性与无机磷组分分析。
1.2 试验方法 1.2.1 根际土采集水稻根际土按照Xie等[13]的方法采集。将成熟期的水稻连根拔起，抖去根系周围大块土壤后黏附在根系上的土壤即为根际土。收集后的根际土分为两份，一份置于–20 ℃用于DNA提取，一份自然风干后用于土壤无机磷组分测定。
1.2.2 无机磷分级及提取无机磷组分提取按照无机磷分级方法[14]进行。其中，铝结合态磷(Al-P)采用0.5 mol/L的NH4F浸提；铁结合态磷(Fe-P)采用0.1 mol/L NaOH提取；闭蓄态磷(O-P)采用HCl-H2SO4高温消解提取；钙结合态磷(Ca-P)采用0.5 mol/L的H2SO4提取；提取后的分级磷含量采用钼锑抗比色法测定。
1.2.3 DNA提取取0.5 g水稻根际土壤，使用试剂盒FastDNATM SPIN(MP Biomedicals，Santa Ana，USA)提取土壤DNA。随后用NanoPhotometer® N50超微量分光光度计(Implen，Munich，Germany)测定样品浓度与纯度，随后置于–20 ℃保存。
1.2.4 高通量测序与分析使用上海昊天生物公司测序平台对根际土壤样品进行pqqC功能基因高通量测序。首先将提取出的土壤DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；再使用Nanodrop 2000检测基因组DNA质量；选取DNA浓度大于20 ng/μL且总量大于500 ng的无杂质DNA样品，进行目的片段检测扩增；随后进行DNA文库构建；准确定量测序文库浓度后进行Illumina上机测序。
1.2.5 pqqC基因定量分析运用RT-PCR技术进行基因丰度测定。pqqC基因采用引物pqqC-F(5′-GAY GARCAYGGHCAYATGTA-3′)和pqqC-R(5′-CCRTAN ACRTCNGCRTANAC-3′)进行扩增。使用10倍连续稀释的质粒制作标准曲线，并通过2−ΔΔCt法计算基因相对丰度。
1.3 数据统计分析所有数据统计分析和可视化均使用R(4.3.1)实现。群落α多样性指数(如香农指数、辛普森指数)采用vegan包的diversity函数计算；采用非度量多维标度分析(NMDS)基于Bray-Curtis距离矩阵评估不同处理间的微生物群落β多样性，并通过vegan包的metaMDS函数进行NMDS计算，结果使用ggplot2进行可视化。此外，采用adonis函数(PERMANOVA)检验不同处理间群落组成的显著性差异。通过stats包的cor.test函数计算优势菌群与环境因子之间的Spearman相关系数，显著水平为P < 0.05，并使用pheatmap包绘制相关性热图。采用Wilcoxon秩和检验分析不同处理间的群落丰度显著性差异，并利用ggpubr包绘制柱状图。
2 结果与分析 2.1 缺磷与加磷处理对水稻根际无机磷组分的影响连续5年进行加磷和缺磷处理后，显著影响水稻根际土壤中的Al-P和Fe-P含量，对Ca-P和O-P的含量没有显著影响(图 1)。其中缺磷处理土壤Al-P含量显著增加，Fe-P含量显著降低，说明缺磷处理可能加快了土壤中Fe-P向Al-P的转化。
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(图中小写字母不同表示处理间差异达P < 0.05显著水平，下同) 图 1 缺磷与加磷处理下土壤无机磷组分变化 Fig. 1 Changes of soil inorganic phosphorus fractions under phosphorus deficiency and phosphorus addition treatments |
连续5年缺磷和加磷处理显著影响水稻根际携带pqqC基因微生物群落的多样性。相比加磷处理，缺磷处理显著提高了携带pqqC基因微生物的香农指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)，而丰富度指数(Richness)和Chao1指数无显著变化(表 1)，说明长期缺磷环境促进了携带pqqC基因微生物的α多样性。
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表 1 缺磷与加磷处理下土壤携带pqqC基因微生物群落α多样性 Table 1 α diversities of pqqC -harboring bacteria communities under phosphorus deficiency and phosphorus addition treatments |
对土壤微生物的pqqC基因丰度进行检测发现，连续5年缺磷处理显著提高了土壤中pqqC基因拷贝数(图 2)，表明长期缺磷条件下会提高携带pqqC微生物的丰度来增加无机磷释放以适应外界缺磷胁迫。
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图 2 缺磷与加磷处理下土壤pqqC基因丰度 Fig. 2 Soil pqqC gene abundance under phosphorus deficiency and phosphorus addition treatments |
非度量多维尺度分析(NMDS)结果表明(图 3)，在缺磷与加磷两种处理下，携带pqqC基因的微生物群落组成存在显著差异(P=0.001)。群落在NMDS二维排序图上明显分开，且分析结果具有良好的拟合度(Stress=0)。
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图 3 非度量多维尺度分析(NMDS)携带pqqC基因微生物群落分布特征 Fig. 3 Distribution characteristics of pqqC -harboring bacteria community by non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) |
连续5年的缺磷和加磷处理显著影响携带pqqC基因微生物群落的菌属相对丰度(图 4)。在缺磷处理中，根瘤菌(Rhizobium)相对丰度最高，达到了43.1%；而在加磷处理中，相对丰度最高的菌属为氢噬菌属(Hydrogenophaga)，相对丰度为62.0%。
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图 4 缺磷与加磷处理下携带pqqC基因细菌群落丰度前10位的优势菌属 Fig. 4 Top 10 dominant bacterial genera of pqqC -harboring bacteria communities under phosphorus deficiency and phosphorus addition treatments |
进一步对两处理组中相对丰度排名前十位的微生物菌属进行差异分析后发现，氢噬菌属(Hydrogenophaga)在加磷处理中显著高于缺磷处理(图 4)。在缺磷条件下，根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)、假杆菌(Piscinibacter)、根瘤杆菌(Rhizobacter)、甲基养菌(Methylibium)相对丰度均显著高于加磷处理。结果表明，在缺磷处理下可能通过塑造不同类别的微生物群落以适应外界不良环境。
2.6 根际携带pqqC基因微生物与无机磷组分的相关性由图 5携带pqqC基因微生物优势菌与无机磷各分级的相关性热图可以看出，假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤杆菌(Rhizobacter)、甲基养菌(Methylibium)和Ramlibacter菌属与土壤Al-P含量呈显著正相关；慢生根瘤菌(Mesorhizobium)与土壤O-P含量呈显著正相关，与土壤Ca-P含量呈显著负相关；土壤Fe-P含量与氢噬菌属(Hydrogenophaga)和Methyloversatilis呈显著正相关，与根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤杆菌(Rhizobacter)、甲基养菌(Methylibium)、假杆菌(Piscinibacter)、Ramlibacter呈显著负相关。
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(图中*、**分别表示相关性达P < 0.05和P < 0.01显著水平) 图 5 携带pqqC基因前十位的优势菌属与土壤无机磷形态的相关性 Fig. 5 Correlation between top ten dominant genera of pqqC - harboring bacteria and soil inorganic phosphorus forms |
缺磷条件下，解磷微生物常通过感受环境变化并提高对解磷物质的合成能力以分解难溶磷并提高土壤无机磷供应能力[15]。前人研究表明，土壤磷循环基因丰度的增加可以提高土壤磷的有效性[16-17]，且过表达pqqC基因菌株能显著提高土壤中有效磷含量[18]。本研究结果表明，缺磷处理下的pqqC基因丰度显著高于施磷处理，这符合土壤微生物组应对外界胁迫时会开启自身防御反应以增加适应环境的现象[19]，并与Gao等[20]认为溶磷功能基因丰度随着磷水平降低而增加的结果一致。这进一步验证了溶磷微生物在缺磷环境下的重要作用。此外，pqqC基因丰度表达与微生物群落丰富度与组成显著相关[21-22]。如通过富集携带该基因的解磷菌改变群落组成，不同种群之间的相互作用影响解磷菌种类多样性。本研究发现，在缺磷处理下，携带pqqC基因的微生物群落香农指数与辛普森指数均显著高于施磷处理，这表明缺磷条件下可能通过提高土壤微生物群落整体的生物多样性水平以响应缺磷胁迫。
一些关键解磷微生物可能在土壤解磷过程中发挥着重要作用，如根瘤菌(Rhizobium)与假单胞菌(Pseudomonas)被认为是土壤中具有较强溶磷能力的微生物[12]。NMDS分析显示，缺磷处理与施磷处理间的微生物群落结构存在显著差异，表明外界磷供应调控了携带pqqC基因微生物群落的组成。进一步对根际土壤携带pqqC基因微生物群落组成分析发现，在缺磷条件下，根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)、假杆菌(Piscinibacter)、根瘤杆菌(Rhizobacter)、甲基养菌(Methylibium)的相对丰度显著提高，表明以上微生物可能在土壤解磷过程中发挥着重要作用。
3.2 土壤中优势解磷微生物对无机磷组分的影响研究表明，酸性土壤中的磷素积累形态以O-P为主，其次为Al-P、Fe-P和Ca-P，土壤无机磷形态受土壤物理与化学、环境等因素影响，其中Al-P与Fe-P是潜在的有效性磷源[23]。土壤解磷微生物参与土壤磷素循环并调控土壤磷供应能力。此前的研究指出，根瘤菌(Rhizobium)在石灰性土壤中对Ca-P的溶解能力较为明显，其解磷机制可能是通过酸化根际土壤的方式动员磷的再活化[24]。此外，假单胞菌(Pseudomonas)是常见的解磷微生物之一，被认为是重要的土壤解磷微生物，参与土壤中难溶性磷酸盐的分解，在土壤磷循环中扮演着关键角色[25-26]。研究表明，解磷菌可促进作物生长并提高产量，比如同时接种根瘤菌与假单胞菌可使小麦产量最高提升40%[27]。此外，通过对不同处理条件下优势菌与无机磷分级之间的相关性分析显示，假单胞菌(Pseudomonas)、Ramlibacter、甲基养菌(Methylibium)和根瘤杆菌(Rhizobacter)与Al-P呈显著正相关关系，表明这些携带pqqC基因的菌属可能参与Al-P的转化与溶解。与此相对应的是，在缺磷处理下，根际土壤中Al-P含量较加磷处理变化显著，而Al-P是土壤有效磷的主要来源[2]。表明这些菌属可以通过提高种群丰度将土壤中难利用的磷组分向更有利于分解或利用的方向转化以适应缺磷环境。而氢噬菌属(Hydrogenophaga)是加磷条件下的优势菌属，相对丰度达到了62%，它与无机磷中的Fe-P呈正相关关系，表明其可能在富磷土壤的磷素转化与养分循环中起重要作用[11, 28]。
4 结论本研究表明，缺磷处理显著提高了水稻根际土壤携带pqqC基因微生物的多样性，改变了其群落结构，同时影响了土壤无机磷形态的分布。缺磷条件下土壤中优势菌属，如根瘤菌(Rhizobium)、假单胞菌(Pseudomonas)的丰度显著提高，且这些关键解磷菌属的丰度与无机磷形态呈显著相关性，表明它们可能在土壤磷循环中发挥重要作用。研究结果揭示了缺磷条件下根际微生物的适应策略，为理解微生物介导的磷循环机制提供了新视角。
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