土壤微生物不仅控制土壤有机质和主要养分的循环过程，其本身还是重要的活性养分库，在土壤养分循环和生物修复等功能中发挥着至关重要的作用^[1-3]。土壤微生物生物量碳、氮、磷含量在一定程度上反映了生态系统物质循环能力、土壤肥力和植物生产力，对环境响应非常敏感，通常被作为土壤质量变化的指示指标。因此，准确测定土壤微生物生物量对全球气候变化背景下碳、氮、磷平衡及其循环机制研究，以及土壤微生物生物量对环境变化响应、对土壤肥力和养分有效性影响等研究具有重要意义^[4-6]。

在前人研究中，土壤微生物生物量磷(MBP)含量测定有多种方法，但存在不确定性。目前，氯仿熏蒸–碳酸氢钠提取法是土壤MBP含量测定的主要方法^[7-8]，其以熏蒸土壤较对照未熏蒸土壤碳酸氢钠提取液中的全磷增量表征土壤MBP含量^[9-10]。该方法消化过程繁琐，且因稀释比例扩大(3倍~5倍)而加大了分析误差。特别对于磷固定能力强和MBP含量较低的土壤，因熏蒸后提取的磷增量过小，导致测定误差相对更大，测定结果不能使用^[11]。早期Brookes等^[12]研究发现，土壤熏蒸处理释放的磷大部分为无机磷，且通过比较4种提取剂的提取效果，发现0.5 mol/L碳酸氢钠溶液的提取效果最为理想，因此建议用此浓度碳酸氢钠溶液提取土壤MBP。但之后Oberson等^[13]与Potter等^[14]研究发现，酸性土壤用碳酸氢钠溶液浸提磷的性能极不稳定，难以获得可靠的MBP含量，而Bray-1法(0.03 mol/L氟化铵–0.025 mol/L盐酸为提取剂)的测定结果较稳定。且一些其他学者也得到了类似的结论^{[11, 15-16]}。

Kouno等^[16]指出，在熏蒸–提取过程中，从微生物细胞释放的磷易被土壤吸附和固定。因此，通常需测定无机磷加标回收率以校正测定结果。Wu等^[11]认为，无机磷回收率低估了土壤MBP含量，主张测定培养微生物MBP的回收率校正测定结果。但实验室培养的微生物的性质、组成及空间分布与土壤原有微生物很难一致，仍有人为的因素存在^[6]。当前，学界主要推荐采用无机磷加标回收率校正测定结果^[17-19]。因此，确定无机磷加标回收率和熏蒸与未熏蒸土壤提取磷的差值(即磷增量)均是测定土壤MBP含量的重要组成，也是方法研究的重点。

目前，国内针对不同方法测定酸性土壤MBP含量的比较分析仍少有报道，导致对于相关情况的认知十分有限，酸性土壤MBP含量测定的方法选择依据尚显不足。为了更加准确地检测，避免因方法选择不当导致测定结果出现较大误差，有必要对不同方法的测定结果进行系统比较分析，验证酸性土壤MBP含量测定的适宜方法，为酸性土壤MBP测定方法的选择提供参考。因此，本研究选择南亚热带酸性土壤为试验土壤，系统比较氯仿熏蒸后分别采用碳酸氢钠浸提法、氟化铵–盐酸浸提法以及盐酸–硫酸浸提法^[20-21]测定的MBP含量及其差异，为酸性土壤MBP测定的标准化提供支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试土样包括采自广西友谊关森林生态系统定位观测研究站的18个土样和采自广西大明山自然保护区的6个土样，共24个样品，依次编号1~24。采集的土样过2 mm筛，分成两份：一份保存于4℃冰箱用于土壤MBP的测定；一份风干后测定土壤pH、有机碳、全磷、有效磷等指标^{[18, 22-23]}。供试土样基本性质如表 1所示。

1.2 测定方法比较试验

24个土壤鲜样调节含水量后于25 ℃密闭培养7 d，之后每个土样各称取9份，每份3.0 g。其中，3份同时放入有氯仿的干燥器中，抽真空至氯仿暴沸2~3 min，再在暗处放置24 h后，开盖除尽氯仿，分别作为氯仿熏蒸–碳酸氢钠浸提(SB)法、氯仿熏蒸–氟化铵–盐酸浸(AFHC)提法和氯仿熏蒸–盐酸–硫酸浸提(HASA)法3种方法的熏蒸土样；3份未熏蒸的土样分别作3种方法的对照土样；3份未熏蒸的土样分别用于测定3种方法的无机磷加标回收率。各样采用上述3种方法重复试验3次。

SB法：取1份熏蒸土样、1份对照土样和1份已加100 mg/L磷标准溶液0.2 mL的未熏蒸土样，分别依次加入60 mL 0.5 mol/L碳酸氢钠溶液、1 g活性炭，振荡30 min，过滤，抽取适量滤液，加入适量去离子水，加入1~2滴2 g/L溴酚蓝指示剂，用0.5 mol/L硫酸调节pH至溶液恰呈黄色，按钼锑抗比色法显色，在UV765紫外分光光度计波长700 nm处测定磷含量。

AFHC法：取1份熏蒸土样、1份对照土样和1份已加100 mg/L磷标准溶液0.2 mL的未熏蒸土样，分别加入30 mL 0.03 mol/L氟化铵–0.025 mol/L盐酸溶液，振荡5 min，过滤(浑浊滤液采用0.45 μm滤膜过滤后检测)，抽取适量滤液，加入适量去离子水，加入1~2滴2 g/L 2, 4二硝基酚指示剂，用0.06 mol/L硼酸和2 mol/L氨水将溶液pH调节至溶液恰呈黄色，按钼锑抗比色法显色，在UV765紫外分光光度计波长700 nm处测定磷含量。

HASA法：取1份熏蒸土样、1份对照土样和1份已加100 mg/L磷标准溶液0.2 mL的未熏蒸土样，分别加入15 mL 0.05 mol/L盐酸–0.025 mol/L硫酸溶液，振荡15 min，过滤，抽取适量滤液，加入适量去离子水，加入1~2滴2 g/L 2, 4二硝基酚指示剂，用0.5 mol/L硫酸调pH至溶液恰呈黄色，按钼锑抗比色法显色，在UV765紫外分光光度计波长700 nm处测定磷含量。

按照公式(1)、公式(2)计算MBP和无机磷加标回收率(R_pi)。

$ {\text{MBP}} = \frac{{E_{\text{pi}}}}{{K_{\text{p}}\cdot R_{\text{pi}}}} $

(1)

$ R_\text{pi}=\frac{\begin{array}{l}（外加磷标溶液土壤磷测定值-\\ 未熏蒸土壤磷测定值）\end{array}}{外加磷量}\times 100\% $

(2)

式中：E_pi为熏蒸与未熏蒸土壤磷含量测定结果差值；K_P为转换系数，取值0.4。

1.3 测定方法精密度试验

称取1~4、19~20号土样各3份，每份3.0 g，分别按上述3种方法测定MBP含量。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2007软件进行数据统计、绘图。采用SPSS 18.0软件构建混合效应模型，分析3种测定方法的差异，并采用Duncan法开展多重比较，采用Pearson相关系数法进行相关性分析。

2 结果与讨论 2.1 3种方法的无机磷加标回收率及磷增量比较

3种方法的无机磷加标回收率和磷增量结果见表 2。3种方法中，24个土样的无机磷加标回收率均值不超过44%。这表明3种方法在浸提过程中均未充分提取加入的无机磷，土壤对磷的吸附与固定作用广泛存在，且作用程度在不同浸提液中呈现一定差异。这与以往研究提出的酸性土壤对磷有较强的吸附和固定作用^[16]相契合。3种方法的无机磷加标回收率两两差异显著(P < 0.05)。无机磷加标回收率大小依次为：AFHC法 > HASA法 > SB法。表明采用SB法和HASA法测定时，土壤对磷吸附和固定作用更强烈，导致磷提取难度更大；采用AFHC法测定时，土壤对磷吸附和固定作用相对较弱，磷提取难度有所降低。

磷增量作为土壤MBP含量测定的核心指标，不仅能够直接反映不同土壤MBP含量差异^[11]，还能体现不同方法提取磷的效果，是评估土壤MBP测定方法的关键依据。本研究(表 2)中，AFHC法、HASA法磷增量无显著差异，二者均显著高于SB法(P < 0.05)。说明SB法提取磷能力显著不足，SB法用于测定酸性土壤MBP含量易产生较大误差。HASA法和AFHC法对土壤中磷提取相对更充分，更适用于酸性土壤MBP含量测定。

HASA法测定过程中，土壤对磷吸附固定作用强烈，磷提取难度大(无机磷加标回收率仅为27.39%)，但仍获得较大磷增量(2.34 mg/kg)，体现了良好的磷提取效果。其原因可能是HASA法较强的酸性环境使熏蒸后的土壤微生物释放的磷溶解量增加，提高了熏蒸样的磷含量，从而使得磷增量增大。此外，本研究结果还表明，HASA法的磷提取效果可能不适宜以无机磷加标回收率衡量，无机磷加标回收率用于校正MBP的合理性有待进一步探讨。

2.2 3种方法测定结果比较

Wu等^[11]研究指出，在酸性(pH_KCl 3.6~5.9)和有机质含量高的土壤中，SB法不能获得可靠的MBP测定结果。本研究中，供试南亚热带24个土壤样品有机碳含量为6~70 g/kg，包含高、中、低3个等级，土壤pH_H2O为3.9~5.0，呈酸性和强酸性，按李朝英等^[22]提出的pH_H2O(Y)与pH_KCl(X)的转化公式Y=1.230X+ 0.130计算，供试土壤pH_KCl为3.1~4.4，供试土壤拓展了已有方法研究中酸性土壤pH区间的下限。

3种方法所测土壤MBP含量见表 3。可见，3种方法的测定均值存在显著差异(P < 0.05)，整体MBP含量表现为HASA法(22.93 mg/kg) > AFHC法(12.88 mg/kg) > SB法(8.38 mg/kg)。SB法无机磷加标回收率与磷增量均显著低于其余两种方法(P < 0.05)，经校正，所得MBP含量均值仍最低，说明SB法提取MBP的能力有限，测定结果代表性较差。AFHC法无机磷加标回收率最优，磷增量与HASA法无显著差异(P > 0.05)，但整体MBP含量显著低于HASA法，该差异主要由两种方法无机磷加标回收率不同导致。

2.3 3种方法测定结果的相关性

3种方法测得的MBP含量的相关性结果见表 4。SB法与AFHC法所测结果的相关系数为0.182 9，两者呈极显著弱相关(P < 0.01)，与HASA法所测结果的相关系数为0.526 5，两者呈极显著强相关(P < 0.01)；AFHC法和HASA法所测结果的相关系数为0.773 9，两者呈极显著强相关(P < 0.01)。

2.4 3种方法的精密度及影响因素

3种方法精密度及影响因素比较见表 5。可见，SB法、AFHC法、HASA法测定MBP含量的变异系数(CV)依次为17.50%、8.81%、8.76%，表明HASA法与AFHC法的精密度良好，均显著优于SB法。

试验过程中，供试森林土壤加入活性炭脱色，因土壤有机物的作用^[24-25]，SB法浸提液仍呈浅褐色或褐色等。在调节酸碱度时，用溴酚蓝代替2, 4-二硝基酚作酸碱指示剂^[26]，颜色突变明显，解决了指示剂颜色被掩蔽的问题。但部分有色滤液在检测波长700 nm处产生背景吸收，吸光度约0.050，降低了测定结果的准确性及稳定性。

部分土壤经AFHC法浸提后，滤液浑浊，仅通过离心处理难以获得澄清溶液，需采用0.45 μm滤膜过滤才能满足比色要求(滤液背景吸光度趋近于0)。该过程操作繁琐费时，明显降低检测效率。AFHC法被认为是测定酸性土壤MBP含量的适宜方法^[13-14]。但受离子交换、电解质浓度、土壤胶体性质等多因素影响，土壤胶体凝聚能力减弱，导致部分酸性土壤浸提液经滤纸过滤后仍存在浑浊现象^[27-28]。本研究中，供试强酸性土壤滤液浑浊问题突出，影响正常检测。综上，AFHC法用于酸性土壤MBP检测存在一定局限性。

HASA法提取液酸性强于AFHC法提取液，在浸提过程中对土壤胶体的凝聚性影响更小，滤液均呈无色或浅黄色澄清状态，背景吸光度趋近0，且用2, 4-二硝基酚调节酸碱度的颜色变化清晰，检测准确度和精密度更高。该方法的浸提效果及适用性优于另外两种方法。

3 结论

SB法的无机磷加标回收率低，磷提取不充分，磷增量偏小，导致所测MBP含量偏低；滤液颜色易造成检测误差，精密度差，检测不稳定。AFHC法的无机磷加标回收率显著高于前者，磷提取效率高，磷增量大，精密度良好，但部分酸性土壤浸提液滤液浑浊，影响检测，适用范围受限。HASA法的无机磷加标回收率低，但磷增量与AFHC法接近，磷提取效率高，且不受土壤有机物及胶体浑浊的影响，滤液澄清，方法准确性和精密度高，适用范围广，推荐用于南亚热带酸性森林土壤MBP含量检测。