2019, Vol. 51
2. 中国科学院大学，北京 100049;
3. 中国科学院环江喀斯特农业生态试验站，广西环江 547100
土壤质量及可持续发展、气候变化问题一直是全球关注的焦点，与这些紧密联系的土壤活性碳组分，尤其是可溶性有机物(DOM)，近几十年来成为研究者研究的热点问题之一[1]。土壤DOM化学组成极为复杂，其去向包括矿化、吸附、转化进入土壤有机质以及以溶解态残留在土壤中，进而影响温室气体排放、土壤养分供应及土壤碳平衡等过程[2-3]。不同DOM化学组成在土壤中的去向差异明显，小分子化合物如有机酸、葡萄糖、氨基酸，极易被微生物利用矿化，而高分子化合物降解性低，通常以稳定形态存在于土壤中[4]；亲水性DOM移动性强、易从土壤中流失，而疏水性DOM易被土壤吸附，参与土壤有机碳(SOC)形成。阐明不同土壤DOM化学组成特征对于理解土壤DOM降解特征及稳定性具有重要意义。
土壤DOM化学组成复杂，主要来源包括SOC、凋落物、根系分泌物及微生物代谢产物。不同来源DOM化学组成、生物降解性差异较大。来源于根系分泌物的土壤DOM以小分子量有机酸为主，降解性高[5]；不同凋落物类型的DOM化学组成及复杂性差异较大，生物降解率表现为灌木 > 乔木 > 草本[6]；木质素来源的DOM含有较多的芳香族化合物，降解性较低[7]。此外，微生物代谢产物是土壤DOM的重要来源，环境因素如温度、土壤基本性质也可以通过改变微生物代谢活性，从而影响土壤DOM组成。可见，土壤DOM化学组成受DOM来源及环境条件共同影响。
旱地和水田是我国亚热带地区农田生态系统两种常见的土地利用方式，以往研究表明，DOM化学组成可能是旱地和水田固碳能力差异的主要因素之一[8]。已有研究结果表明旱地DOM芳香性和腐殖化程度高于水田[9-10]，但这不能全面反映土壤DOM的化学组成与分子特征。现有关于农田土壤DOM化学组成研究多偏向于控制因子性试验，对自然环境条件下农田土壤DOM化学组成的了解有待深入。受人为耕作管理措施影响，农田生态系统环境因素比自然生态系统更为复杂。旱地和水田因农作管理措施差异，土壤物理化学和生物学性质明显不同[11-12]，水田土壤微生物活性高于旱地土壤；不同有机物料来源的DOM化学组成多样化，不同施肥习惯也可能影响DOM化学组成。并且不同地貌区土壤性质、气候因素及农作管理习惯存在较大差异，通过影响微生物代谢过程改变土壤DOM化学组成[13-14]。基于此，本研究分析亚热带典型地貌下的旱地和水田土壤DOM化学组成，阐明土壤DOM化学组成的主要影响因素，以期为揭示农田SOC周转机制及固碳机理提供基础。
1 材料与方法 1.1 土壤样品采集研究区包括我国亚热带区域喀斯特山区(广西环江)、红壤丘陵区(湖南常德)及平原湖区(湖南岳阳)，气候类型为亚热带季风气候。喀斯特山区、丘陵区和平原湖区的年降雨量分别为1 750、1 437、1 423 mm，平均气温分别为19.9、16.5、16.9℃。每个地区于休闲期(3月)和耕作期(7月)随机采集5对连续耕作20 a以上的相邻旱地和水田土壤(样地信息及土壤基本性质见表 1)，每个田块按照“S”形采集多点表层(0 ~ 15 cm)土壤样品混合成1个土壤样品，置于聚丙烯袋中并密封，尽快运回实验室于4℃保存。指标分析前，将土壤中的根系和石砾挑除，并把土壤分成两部分，一部分置于4℃备用于可溶性有机物(DOM)提取，另一部分在室温下风干，用于测定土壤水分、SOC和pH。
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表 1 旱地和水田样地信息及土壤基本性质 Table 1 Detailed geographical information and basic properties in upland and paddy soils sampled |
称取一定量的土壤鲜样，在土水比(m/v)为1:2，20℃条件下200 r/min振荡1 h；将浸提液在4℃ 12 000 r/min下离心10 min；所得上清液过0.45 μm微孔滤膜，即为DOM溶液[15]。所得DOM溶液分为3部分，分别进行DOC含量测定、分组及冷冻干燥。
DOM分组步骤如下：使用XAD-8离子交换树脂(安伯来特)对DOM进行亲水和疏水性组分的分组[16]。在分组前，XAD-8树脂在索氏抽提器中分别用甲醇、乙腈、乙醚清洗。清洗干净的XAD-8树脂装入玻璃填充柱中(直径0.7 cm)，然后分别用超纯水、甲醇、0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl充分淋洗，最后再用超纯水反复润洗。分组时，将DOM溶液pH用HCl调为2.0，保持蠕动泵流速为0.6 ~ 0.7 ml/min，将溶液过XAD-8树脂柱，滤液即为亲水性组分，而疏水性组分吸附在XAD-8树脂中。
DOM溶液冷冻干燥所得DOM固体用热裂解气相色谱-质谱联用仪(Py-GCMS)测定DOM化学组成。具体步骤为：0.5 mg DOM固体样品添加四甲基铵氢氧化物(TMAH)溶液(溶于甲醇中)后在400 ℃下热化学裂解30 min，热裂解产物置于气相质谱联用仪上进行自动分析。分析过程如下：1 μl样品被自动注射到气相色谱中，该色谱仪连接有分裂模的毛细管注射器(分裂比为30:1，温度恒定为250 ℃)和熔融石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm，膜厚度0.25 μm)。载气为氦气，其流速为1.8 ml/min。校准用标准物质为异辛烷八氟萘。柱式加热炉的初始温度设定为80 ℃并保持1 min，然后以4 ℃/min的速度上升至180 ℃，再以10℃/min的速度上升至320 ℃，并保持10 min。质谱分光光度计经校准后在全扫描模式下进行操作，扫描范围为m/z = 50 ~ 1 200，电子冲击离子化能量为70 eV，扫描速度为1.0 s/san。运用NIST质谱数据库和软件(NIST 2002, Perkin-Elmer, USA)对产物质谱图进行匹配鉴定，通过裂解产物的质谱与数据库质谱图的详细对比可识别产物名称[17]。相比于其他方法，Py-GCMS技术前处理不复杂、测定组分多样化，尽管该技术的检测物为裂解物，但根据已有文献结果，可将裂解产物归类为原DOM化合物组分[18-19]。
1.2.2 指标测定土壤基本理化性质采用鲍士旦[20]主编的《土壤农化分析》中常规方法测定；滤液中的DOC和分组所得亲水性DOC用岛津TOC-5050A总有机碳仪测定；DOM中芳香族物质含量的测定：将DOC含量稀释为2 mg/L，在紫外分光光度计254 nm下测定其分光光度值(E254)，即代表DOM中芳香族物质含量[21]。
1.3 数据处理疏水性DOC含量为DOC总含量与亲水性DOC含量的差值；采用R语言进行Random Forest分析和Adonis分析。Random Forest分析使用R分析软件中的randomforest安装包进行，预测变量对响应变量的重要性则根据rfpermute安装包进行。Adonis分析使用R分析软件中的adonis安装包进行。
数据处理和分析用Microsoft Excel 2003和SPSS18.0软件完成；利用Origin8.0软件进行作图。
2 结果 2.1 土壤DOC含量与芳香性特征休闲期，喀斯特山区和平原湖区水田DOC含量为66.7、39.3 mg/kg，显著高于旱地土壤；丘陵区水田土壤DOC含量(21.6 mg/kg)略高于旱地土壤(17.0 mg/kg)，差异未达显著水平(图 1)。休闲期和耕作期，喀斯特山区和平原湖区水田土壤DOC含量差异显著，而丘陵区水田土壤DOC含量无显著差异。两个时期，各地貌下旱地土壤DOC含量变化较小。
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(图中山区、丘陵、平原分别代表喀斯特山区、丘陵区和平原湖区；不同小写字母表示同一地貌区不同土地利用方式间的差异达P < 0.05显著水平) 图 1 DOC含量及芳香性 Fig. 1 DOC content and its aromaticity |
E254值表示DOM芳香化指数，其大小与DOM中芳香化合物比例成正比。两个时期，喀斯特山区旱地DOM芳香性显著高于水田，而丘陵区和平原湖区，水田DOM芳香性总体大于旱地，其中在耕作期丘陵区水田DOM芳香性显著高于旱地。
2.2 土壤亲水和疏水性DOC含量Adonis分析结果表明，不同土地利用方式(旱地和水田)和时期(休闲期和耕作期)下亲、疏水性DOC含量差异达极显著水平(P < 0.01)，而不同地貌区两种DOC含量差异不显著(表 2)。休闲期，水田亲、疏水性DOC含量分别为10.2、33.4 mg/kg，显著高于旱地土壤(4.15、12.8 mg/kg)；而耕作期，旱地和水田亲、疏水性DOC含量差异不显著(图 2)。此外，旱地和水田两种DOM组分随时期响应变化不同。水田亲、疏水性DOM耕作期显著低于休闲期；而旱地两种DOM组分含量在休闲期和耕作期差异不显著(P > 0.05)。
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表 2 基于Adonis分析的不同土地利用方式、时期及地貌下亲水及疏水DOC含量显著性差异 Table 2 Significant differences in Hi- and Ho-DOC contents between different land use types, periods and landforms based on adonis test |
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(图中不同小写字母表示同一时期不同土地利用方式间的差异在P < 0.05水平显著) 图 2 旱地和水田土壤亲水及疏水性DOC含量 Fig. 2 Hi- and Ho-DOC contents of upland and paddy soils |
脂类和有机酸是旱地和水田DOM的主要化学组成(图 3)。旱地和水田中有机酸相对比例以休闲期高于耕作期(P < 0.05)，休闲期分别为31.9%、35.6%，耕作期分别降至17.9%、20.0%。两时期下脂类相对比例与有机酸趋势相反，旱地和水田土壤DOM中脂类相对比例在休闲期分别为55.0%、49.5%，耕作期则分别显著增至70.1%、62.9%。Adonis分析结果表明，休闲期和耕作期，土壤DOM化学组成差异显著；喀斯特山区和丘陵区以及丘陵区和平原湖区的DOM化学组成差异显著(表 3)。采用Random Forest分析进一步阐明DOM具体组分在各因素下的显著性差异，结果表明，有机酸和脂类相对比例在不同时期差异显著，而芳香化合物相对比例在不同地貌区差异显著(图 4)。
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(图中不同小写字母表示同一土地利用方式不同时期间的差异在P < 0.05水平显著) 图 3 旱地和水田土壤DOM中有机酸及脂类相对比例 Fig. 3 Relative proportions of organic acids and lipids in DOM in upland and paddy soils |
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表 3 基于Adonis分析的不同土地利用方式、时期及地貌下DOM化学组成显著性差异 Table 3 Significant differences in DOM compositions between different land use types, periods and landforms based on Adonis test |
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图 4 基于Random Forest分析的不同因子下主要DOM化学组成显著性差异 Fig. 4 Significant differences in primary DOM compositions under different factors based on Random Forest test |
与多数研究结果相同[22-23]，DOC含量在不同土地利用方式、时期下差异显著。休闲期水田土壤DOC含量高于旱地，这与韩成卫等[24]以水为提取剂、过0.45 μm滤膜方法提取DOC的研究结果一致，但也有研究以水为提取剂、过滤纸方法提取DOC，结果表明旱地DOC含量高于水田[25]。这说明，提取方法对DOM性质影响较大。土壤DOC含量(包括亲、疏水性DOC)受SOC含量及时期共同影响，本研究休闲期3个地貌区土壤DOC(亲水及疏水DOC)含量均表现为水田大于旱地，这与水田SOC高于旱地是一致的。多数研究结果也指出，旱地和水田DOC含量与SOC含量表现为正相关关系[26]。水田作物生长及人为管理措施在休闲期和耕作期差异较大，休闲期温度低、人为干扰少以及土壤长期浸水导致DOC含量较高；尽管耕作期作物根系分泌物会增加根际土壤DOC含量，但由于温度较高、人为管理措施频繁，水田微生物活性高于休闲期，导致该时期DOC含量降低[27-28]。本研究两个时期间，旱地土壤DOC含量稳定，而水田波动较大，这可能与旱地DOC化学组成比水田更复杂有关。
不同土地利用方式下土壤DOM化学组成差异较大。有研究通过比较不同土地利用方式(森林、草地、林地)土壤DOM化学组成，结果发现植被类型对DOM化学组成影响较大[29]。森林土壤植被类型以木本科植物为主，农田土壤则以禾本科植物为主，比如水稻、玉米和小麦等。来源于木本科和禾本科植物的DOM化学组成差异很大，即木本科植物凋落物来源的DOM通常比禾本科作物来源DOM含有更多的木质素和其他难降解性化合物组分[30]，这是导致森林土壤DOM化学组成比农田土壤DOM复杂的一个主要原因。本研究结果表明土地利用方式对DOM化学组成影响不明显，这可能与农田土壤种植作物以禾本科作物为主有关。
本研究通过Py-GCMS技术测定DOM化学组成，结果表明脂类和有机酸是DOM的主要组分并随时期显著变化，而芳香化合物组分在不同地貌区差异较大。这说明，DOM化学组成的影响因素取决于化合物种类。土壤DOM化学组成复杂，根据降解特征可分为易降解组分(糖类、氨基酸、有机酸)、难降解组分(芳香化合物、木质素来源的酚类化合物)[31-32]。环境条件变化影响微生物代谢活性，导致微生物代谢相关组分含量改变。土壤DOM组分中，有机酸易被微生物降解利用，而微生物代谢转化产物是脂类物质的一个主要来源[33]。尽管耕作期作物根系分泌物中有机酸丰富，但耕作期土壤微生物活性高于休闲期，土壤微生物对有机酸利用增强，代谢转化产物增多，导致DOM中有机酸显著降低、脂类含量显著升高。此外，芳香化合物在土壤DOM中含量较少，但却是指示DOM稳定性的一个重要指标[34]。难降解DOM组分主要受来源途径影响，环境及微生物代谢过程影响较小[35]。有机肥是农田土壤DOM芳香化合物的主要来源之一[36-37]，本研究结果表明不同地貌区土壤DOM芳香化合物比例相差较大，可能是由于不同地貌区农田农作管理措施差异(比如施肥)引起的。本研究阐明土壤DOM组成结构在不同土地利用方式、地貌区及时期的显著性差异，但不同土地利用方式、地貌区以及时期下气候因素、土壤环境及农作管理措施都存在较大差别，影响DOM组成结构的关键因子还需进一步研究。
4 结论休闲期，亲、疏水性DOC含量以水田显著高于旱地，耕作期无显著性差异；水田亲、疏水性DOC含量随时期变化明显，旱地两组分DOC含量相对稳定。与休闲期相比，耕作期旱地和水田土壤DOM中有机酸均显著减少，脂类显著增加，可见土壤环境、作物生长及人为管理措施变化对微生物代谢相关化合物影响较大。芳香化合物作为DOM稳定组分，在不同地貌区差异较大，可能与不同地貌区农田土壤施肥差异有关；而芳香化合物在不同时期差异不显著，说明土壤DOM稳定性组分主要受其来源影响。本研究揭示了田间条件下旱地和水田DOM随时期的变化特征，并阐明了DOM中微生物代谢相关组分(有机酸、脂类)和稳定性组分(芳香族化合物)在不同因子下的显著性差异，对于评价旱地和水田DOM稳定性及固碳机制具有一定的参考意义。
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2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
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