我国耕地土壤污染严重。据2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示,我国土壤总点位超标率为16.1%,耕地土壤点位超标率为19.4%(相当于2 600万hm2)。从污染物超标情况看,Cd污染点位超标率为7.0%,占据第一位[1]。此外,近30 a来,我国土壤中的Cd含量急剧增加,年平均增加0.004 mg/kg,远高于欧洲地区(年平均增加0.000 33 mg/kg)[2]。按照这种增长速率,50 a后我国土壤Cd含量将增加一倍[3]。
Cd具有极高的生物毒性,在土壤中迁移性很强,易通过植物根系的吸收在植物体内积累,不仅会抑制植物生长发育、影响植物的品质和产量,还可能经过食物链进入人体,对人类的健康造成严重威胁[4-5]。因此,进行土壤Cd的生态风险评价十分重要。通过评价土壤Cd生态风险,计算Cd毒性阈值,为控制Cd进入土壤系统提供量化指标,并为土壤环境质量Cd标准的修订提供依据。另外通过研究生物体对土壤Cd的解毒过程,或可为Cd污染土壤的修复提供基础数据[6]。建立污染物的剂量-效应关系是评价污染物生态风险的主要途径之一[7],对此国内外已有不少报道:Rooney等[8-9]建立了Cu和Ni对西红柿和大麦毒害的生态毒理学模型; 林春野[10]研究比较了Cu、Cd、Zn对小麦和油菜的生态毒性及2种植物对3种重金属的毒性敏感性; 陈世宝等[11]进行了基于不同测试终点的土壤Zn毒性的研究。但由于污染物对植物的剂量-效应关系可能随着土壤性质、测试终点的变化而变化,具有很大的不确定性,而土壤种类、测试终点的选取直接影响着污染物风险评价的结果。因此,开展不同土壤、基于不同测试终点的毒理学评价对于Cd污染土壤的环境风险评价具有重要意义。
大麦(Hordeum vulgare L.)是我国种植的主要作物之一,具有较高的食用价值和经济价值。同时它也是一种Cd敏感粮食作物[12]。多年生黑麦草(Lolium perenne L.)为禾本科多年生草本植物,是重要的栽培牧草和绿化植物[13]。大麦和黑麦草常被用作毒理试验材料[12, 14]。重金属对植物有深远的毒害影响,致使植物在种子萌发、幼苗生长和结实等不同生长发育阶段都可能受到毒害作用。本文选择我国具有宽广pH范围(4.77 ~ 8.24)的14种土壤,利用大麦和黑麦草2种植物开展植物毒害试验,以大麦根长、黑麦草发芽率及黑麦草地上部生物量作为评价指标,研究了在不同土壤条件下,不同Cd含量水平对2种植物的毒害作用及其敏感性,得到基于各评价指标的Cd毒性阈值,并与土壤理化性质建立联系,以期为我国土壤Cd污染的生态风险评价、管理与土壤环境质量标准的修订提供数据支持。另外,许多研究指出[13, 15],多年生黑麦草对土壤Cd有较强的富集作用,具有成为修复材料的潜力。因此,本研究也评价了不同土壤条件下黑麦草对土壤Cd的富集能力,为我国Cd污染土壤的植物修复提供修复材料和理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试土壤在全国14个地区采集土壤样品(表 1),其中酸性土壤(pH<6.5) 8种、中性土壤(6.5 ≤pH<7.0) 2种、碱性土壤(pH≥7.0) 4种。土壤Cd含量0.03 ~ 1.56 mg/kg,这些土壤代表了我国主要土壤类型,且土壤性质差异很大。土壤采集后自然风干,去除石子、草根等杂质,过4 mm筛,装入桶中于室温下保存。另取少量样品过2 mm和0.15 mm筛,分别用于土壤理化性质常规分析和Cd含量测定。
土壤pH使用玻璃电极按土水比1:2.5测定; 根据重铬酸钾容量法-外加热法测定土壤有机质含量(soil organic matter,SOM); 阳离子交换量(cation exchange capacity,CEC)采用氯化钡缓冲液法测定[16]; 土壤机械组成使用激光粒度仪测定。供试土壤基本理化性质见表 1。
1.2 植物毒害试验根据国际标准组织(international organization for standardization,ISO)标准方法,采用大麦和黑麦草分别进行植物根长试验(ISO 11269-1)[17]和生长试验(ISO 11269-2)[18]。
1.2.1 老化处理在14份风干土壤(过4 mm筛)中添加不同浓度的外源Cd,Cd以CdCl2 (CdCl2·2.5H2O,分析纯)溶液形式加入土壤中,设置8个Cd添加水平:0、2.5、5、10、25、50、100、200 mg/kg(以Cd元素计),每个处理3次重复,将土壤拌匀。当外源Cd添加水平为0 mg/kg时,土壤Cd含量为各土壤Cd本底值,即对照处理。
李传飞等[19]、吴曼等[20]研究表明,外源添加的Cd进入土壤后,其稳定化作用主要发生在前15 d,因此确定土壤老化时间为2周。老化处理结束后,每份土壤取少量(过0.15 mm筛),测定其Cd含量。
植物毒害试验于玻璃温室内进行,每日光照12 h,温度控制在(25 ± 2)℃。
1.2.2 大麦根长试验将饱满均一的大麦(Hordeum vulgare L.)栽培品种“Baudin”种子置于30 ℃恒温培养箱催芽,待种子胚芽露白(胚根<2 mm)后,播种于塑料管(φ45 × 100 mm)中。为保证空气交换,塑料管底部留4个小孔。每根塑料管5颗种子,用去离子水保持土壤水分为田间持水量的60%,培养5 d后从塑料管中完整取出发芽的大麦,记录每株大麦的最长根长,以同一塑料管5株大麦的最长根长的平均值作为一个重复,每个外源Cd处理下,共有3个塑料管,即3个重复。
1.2.3 黑麦草Cd毒害试验正式试验前进行黑麦草盆栽试验的预试验,设置8个Cd添加水平:0、5、10、25、50、100、200、500 mg/kg(以Cd元素计)。黑麦草种植于塑料盆钵(φ100 × 90 mm)中,盆底垫纱网以防土壤漏出。挑选健康饱满的多年生黑麦草(Lolium perenne)“Derby”商品种子20颗,均匀播种在土壤表层,用去离子水浇灌,土壤水分保持在田间持水量的60%。出芽后每盆定植10株,培养30 d后,剪下黑麦草地上部(离土面0.5 cm),用去离子水洗净擦干并记录鲜物质量。然后置于65 ℃烘箱(Memmert, UNE-500 / UNE-600,德国)烘干至恒重,记录干物质量。
1.3 土壤、植物Cd含量测定植物样品加入5 ml混酸(HNO3/HClO4,87/13,V/V,优级纯),使用石墨炉消解仪(SH220,上海海能)消解[21]。土壤样品加5 ml王水(HCl/HNO3,4/1,V/V,优级纯),使用同上石墨炉消解仪消解[22]。植物、土壤Cd含量采用电感耦合等离子质谱仪ICP-MS (PERKIN-ELMER,NexION 300X,美国)测定。分析过程中加入土壤(GBW 07428)及植物(GBW 10015)标准物质进行质量控制。Cd回收率分别为103% ~ 109%和91% ~ 108%。
1.4 数据分析数据统计和方差分析使用Excel 2007和SPSS statistics 20,采用SigmaPlot 12.5绘图,数据离散程度以标准差SD表示。
Cd毒性阈值采用ECx(effective concentration)表示,剂量效应使用Log-logistic曲线拟合, 拟合方程如下:
$ y = \frac{{{y_0}}}{{1 + {e^{(b(x - M))}}}} $ | (1) |
式中:y为各处理浓度下相对根伸长/相对生物量(%),即Cd处理组大麦根长或黑麦草地上部生物量与对照组的比值,x为外源Cd的添加水平(mg/kg)。y0, b, M为拟合参数,M为毒性阈值ECx (mg/kg)。x为10、50时,M分别表示EC10、EC50,即大麦根伸长或黑麦草地上部生物量受到10%、50%抑制时的土壤Cd含量。
2 结果 2.1 土壤Cd对大麦根长的影响对老化后的土壤进行Cd含量检验,土壤Cd含量实测值与外源添加Cd水平极显著线性相关,相关系数r>0.995 (P <0.01),表明外源添加Cd水平较好地反映了土壤实际Cd含量。
14份土壤理化性质见表 1。除广西河池(Cd = 1.56 mg/kg)、广西崇左(Cd = 0.34 mg/kg)、湖南湘乡(Cd = 0.44 mg/kg)外,其他地区土壤Cd含量均低于国家土壤环境质量二级标准(GB15618—1995)。14个地区的土壤对照处理间比较,大麦根长差异显著(P<0.01),与土壤CEC呈显著负相关(r= -0.616,P<0.05)。外源添加Cd含量为2.5 mg/kg时,与对照相比,除广东肇庆、福建泉州和安徽合肥土壤中大麦根生长不受影响外,其余土壤中大麦根生长均受到抑制。外源添加Cd含量≥5 mg/kg时,大麦根长急剧下降。与对照相比,外源添加Cd含量达到200 mg/kg时,对大麦根生长的抑制>70%,其中以江西鹰潭土壤抑制率最显著,高达89%(图 1)。图 1为Log- logistic模型方程拟合的大麦相对根长与土壤外源添加Cd含量的剂量效应曲线(R2>0.90, P <0.01)。
由图 2可知,外源添加Cd含量为5 ~ 25 mg/kg时,与对照相比,外源添加Cd处理对黑麦草种子发芽有促进作用。外源添加Cd含量为50 ~ 200 mg/kg时,发芽率缓慢下降。当外源添加Cd含量为500 mg/kg时,江西鹰潭、广东肇庆、广东韶关、辽宁沈阳、山东临朐土壤中种子发芽率下降明显,与对照相比,抑制率分别为92%、41%、33%、34%和14%。而其余9份土壤中种子发芽率基本不受影响。
由图 3可知,外源添加Cd含量为5 mg/kg时,与对照相比,Cd处理均促进了黑麦草地上部的生长,其中福建泉州土壤上黑麦草生物量增加最高,达到了48%。当外源添加Cd含量达25 mg/kg时,除广西河池、湖北宜昌、福建泉州和山东临朐土壤的黑麦草生物量仍高于对照土壤外,其余10份土壤黑麦草生长均受抑制,江西鹰潭土壤上黑麦草生物量下降最显著,抑制率为58%。外源添加Cd含量为25 ~ 500 mg/kg时,黑麦草生物量随土壤Cd含量增加而呈现下降趋势。与对照相比,外源添加Cd含量达500 mg/kg时,江西鹰潭、广东韶关和福建泉州土壤上黑麦草完全死亡,而其他11种土壤上黑麦草生长的抑制率均大于40%。
14份土壤中外源Cd对大麦根长的毒性阈值变异很大,EC50值为7.8 ~ 61.7 mg/kg,相差7.9倍; EC10值为0.2 ~ 5.4 mg/kg,相差28.9倍。由Pearson相关性分析(表 2)可知,EC50值与土壤pH显著正相关(r = 0.788,P<0.01),而与CEC、SOM、砂粒含量等土壤性质没有显著相关性。EC10与其呈现相似规律,与土壤pH显著正相关(r = 0.615,P <0.05),与其他土壤性质无显著相关性。土壤pH解释了大麦EC50值62.1%的变异,EC10值37.8%的变异。这说明土壤pH是影响Cd生物毒性的主要因素之一。
对黑麦草地上部生物量而言,14份土壤中外源Cd的毒性阈值差异显著,EC50值为29.7 ~ 499.7 mg/kg,相差16.9倍; EC10值为4.4 ~ 200.0 mg/kg,相差45.4倍。Pearson相关性分析(表 2)表明,黑麦草地上部EC50、EC10值与各土壤性质相关性均不显著(P>0.05)。
2.3.2 黑麦草对Cd的积累黑麦草Cd含量与土壤Cd全量线性方程见表 3(由于高Cd含量时部分黑麦草生长受到严重抑制,收获的地上部数量不足以后续的Cd含量分析,因此这里取拟合的最高土壤外源添加Cd含量为100 mg/kg),两者表现出极显著的线性相关(P <0.05)。以方程斜率k值表征黑麦草对Cd的富集能力。在酸性土壤(4.77≤pH≤6.48)中,k值为0.87 ~ 3.91;碱性土壤(7.28≤pH≤8.24)中,k值为0.53 ~ 0.75。
Pearson相关分析(表 4)表明,k值与土壤pH在P<0.01水平上极显著负相关,即土壤pH为4.77 ~ 8.24时,黑麦草对Cd的富集能力随pH升高而降低。
一般认为,低含量的Cd对种子萌发、幼苗生长有刺激效应,高含量的Cd则表现出抑制效应。本试验中,土壤中外源添加Cd含量为5 ~ 25 mg/kg时,观察到黑麦草种子发芽率、地上部生物量高于对照,而高Cd含量处理下(25 ~ 500 mg/kg),黑麦草生长受到抑制。冯鹏等[23]、李慧芳等[24]的研究也观察到类似现象。孙聪等[25]的研究也表明,外源Cd含量分别为1.2和4.8 mg/kg时,水稻生物量最高,比对照增加4% ~ 56%。这可能是由于低含量Cd提高胚的生理活性,促进了种子萌发; 而高含量Cd对胚、芽产生伤害作用,且抑制了淀粉酶、蛋白酶活性[26]。与此不同的是,在低含量Cd处理下,Cd对大麦幼根的生长表现为抑制作用。这说明Cd胁迫对根的抑制大于芽,这与杨明等[27]、周青等[26]研究结果相同。
不同物种、不同品种的植物对土壤Cd毒害的响应不同,丁枫华等[28]研究了23种作物对Cd毒害的敏感性差异,发现不同作物地上部鲜重EC50有较大差异; 宋文恩等[29]针对3种水稻品种开展了根长试验,指出不同品种在同一种土壤上,EC50、EC10均存在较大差异。本试验中大麦根长EC50值为7.8 ~ 61.7 mg/kg,EC10值为0.2 ~ 5.4 mg/kg,黑麦草地上部生物量EC50值为29.7 ~ 499.7 mg/kg,EC10值为4.4 ~ 200.0 mg/kg。14份土壤中,除湖南湘乡土壤外,大麦EC50值均低于黑麦草; 所有土壤中大麦EC10值比黑麦草EC10值更低。这说明大多数土壤条件下,大麦对Cd生物毒性的响应比黑麦草更为灵敏。
大量研究表明,土壤性质对固相Cd吸附、液相Cd形态有着显著影响[30-32],从而影响Cd的可利用性,其中pH是最重要的因素之一[33-35]。和军强等[36]研究表明,pH为影响HC5(保护95%稻米品种的土壤Cd限值)的最主要因子,可控制HC5变异的62.2%。一般来说,Cd的溶解度随pH升高而下降,因此碱性土壤中Cd的生物有效性较低[2, 37-38]。根据经验,下降1个单位的土壤pH可能使土壤Cd的可利用性增加1.5倍[2]。本试验中不同土壤大麦根长和黑麦草地上部生物量的ECx 值变异很大,EC50分别相差7.9和16.9倍,EC10值分别相差28.9和45.4倍。这说明利用EC10的统计不确定性高于EC50,与已有研究结果相同[29, 39]。相关性分析表明大麦根长EC50、EC10值与土壤pH呈显著正相关,土壤pH越低,ECx值越低,植物越容易受到Cd胁迫。且由于EC50的变异性更小,因此EC50与土壤性质之间的相关性比EC10更强。宋文恩等[29]通过根长试验指出水稻毒性阈值ECx 与土壤pH呈正相关,与本研究内容一致。因此在评价土壤中Cd的生物毒性时,应充分考虑土壤性质之间的差异。但本试验中基于黑麦草生物量ECx值与土壤性质无显著相关性,因此土壤性质对黑麦草的作用可能更为复杂。
研究表明植物地上部Cd含量主要取决于土壤中Cd含量,另外也受到土壤性质的影响[40-41]。本试验中,随着土壤Cd含量的升高,Cd在黑麦草地上部的积累增加,且两者线性相关。方程斜率k值与土壤pH显著负相关。当土壤pH<6.5时,k值为0.87 ~ 3.91;土壤pH≥6.5时,k值为0.53 ~ 0.95,即一般情况下,在酸性土壤中,黑麦草对Cd的富集能力要强于碱性土壤。本试验中,每一盆黑麦草收割一茬可以从土壤中移除0.05 ~ 124 µg Cd(黑麦草地上部干物质量×Cd含量)。经过多次刈割,可以逐步减少土壤中Cd含量。由于黑麦草具有先锋植物特性和可以多次刈割并再生的特点[23],且黑麦草对Cd具有很强的抗性,对Cd有富集作用,因此黑麦草对Cd污染土壤的修复有着很好的应用前景。
4 结论1) 在不同测试终点下,土壤Cd的毒性阈值有较大差异,敏感顺序为大麦根长>黑麦草地上部生物量,大麦对Cd的生物毒性的响应比黑麦草更为灵敏。
2) 不同土壤条件下Cd对植物的毒性阈值有较大差异,大麦根相对伸长量的EC50、EC10值与土壤pH呈显著正相关。而Cd对黑麦草的毒性阈值变异性更大,与土壤性质无显著相关性。
3) 黑麦草地上部Cd积累量随着土壤Cd含量升高而增加。黑麦草对Cd的富集能力与土壤pH显著负相关,在酸性土壤中,黑麦草对Cd的富集能力更强,黑麦草具有对Cd污染土壤的修复潜力。
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