2020, Vol. 52
2. 中国科学院大学，北京 100049
碳和氮是植物体内两大重要元素，其化合物在植物的生命代谢过程中起着至关重要的作用，因此碳和氮代谢是植物体内最重要的两大代谢过程[1]。碳氮代谢相互影响，相互制约。氮主要通过铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)两种离子形态吸收进入植物体内[2-3]。适量的NH4+能够促进植物生长[4-6]，但是过量的NH4+则会对植株的生长产生毒害作用[7-8]，主要表现有植物根系粗短，根冠比下降，叶子黄化，同时还会抑制种子发芽，甚至严重的会导致植株死亡。已有研究表明，植物对铵态氮的吸收主要是通过铵转运蛋白家族(ammonium transporter，AMT)来负责[9-10]。当根系周围因施用氮肥而出现局部NH4+浓度较高(≥1 mmol/L)时，由AMT所介导的NH4+吸收作用达到饱和，根系的NH4+吸收能力不再随NH4+浓度的增加而增强[11]。
糖作为植物体内重要的大分子物质，不仅参与光合作用中的碳代谢，为氮代谢提供能量和碳架[12]，还可以作为信号分子被植物细胞感知[13]，在己糖激酶、糖代谢中间物以及糖分子水平展开其调节能力[14]。除此之外，糖也能参与植物氮同化酶的调节，可以促进离体植物叶片中硝酸还原酶(NR)在转录水平上的表达[15]；外源蔗糖还可以显著提高烟草叶片中谷氨酰胺合成酶(GS)的活性[16]，缓解高NO3-胁迫对叶用莴苣生长的抑制[17]。
本试验以拟南芥铵转运蛋白基因的T-DNA突变体和野生型为材料，通过比较外源添加蔗糖下，AMT的T-DNA缺陷体及野生型在高NH4+胁迫下碳、氮代谢关键酶活性等指标的变化，探索高NH4+胁迫下外源蔗糖维持拟南芥碳、氮代谢平衡机理，为减轻NH4+胁迫对作物的毒害作用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 材料野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia)为本实验室保存(下文简称col-0)。Salk-063887C (下文简称amt1.1)和CS372164 (下文简称amt1.3)这两个AMT的T-DNA插入突变体购自ABRC (www.arabidopsis.org)。
2Mix rTaq，RNAiso Plus和PrimeScript TMII RT试剂盒以及TaKaRa Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。其他生化试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 试验方法 1.2.1 拟南芥植株幼苗准备拟南芥植株幼苗培养方法参考文献[18]，光照培养箱的温度为23℃ ± 1 ℃，光周期为16 h光照、8 h黑暗，光照强度为100 μmol/ (m2·s)。培养基成分根据Yuan等[19]修改得：2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，250 μmol/L K2SO4，250 μmol/L CaCl2，100 μmol/L Na-Fe- EDTA，50 μmol/L KCl，50 μmol/L H3BO3，5 μmol/L MnSO4，1 μmol/L ZnSO4，1 μmol/L CuSO4，1 μmol/L Na2MoO4，1 mmol/L MES-KOH(2-码啉已磺酸)，1% (m/V)蔗糖，0.8%(m/V)琼脂，pH 5.7。纯合体拟南芥种子先用10% (V/V)的次氯酸钠和0.1%(m/V)SDS(十二烷基硫酸钠)消毒5 min，然后用灭菌水清洗干净(5次)，置4 ℃低温避光保存48 h后播种于培养基(10 cm×10 cm)上，密封。将培养皿直立地置于光照培养箱中，让根沿琼脂表面向下生长。
1.2.2 高NH4+胁迫下外源添加蔗糖试验拟南芥植株幼苗在培养基上生长7 d后，挑选长势一致的移植到泥炭土:蛭石:石英砂=3:3:1的基质中接着生长。基质使用前用清水漂洗，尽可能除去里面所含有的营养物质。基质培养时光照强度同培养基培养。营养液配方参照培养基配方，但不含有蔗糖和琼脂。每周每组浇灌1 L营养液。待苗龄21 d后，分为3组进行处理，将营养液配方中NH4NO3更换为NH4Cl，其余成分与之前一致。处理分为3组，CK处理使用的营养液为常规营养液(4 mmol/L NH4+)，T1处理使用的营养液为NH4+胁迫营养液(20 mmol/L NH4+)，T2处理使用的培养液为NH4+胁迫营养液(20 mmol/L NH4+)加5%(m/V)蔗糖，每周浇灌1次，每次浇灌1 L，使基质充分浸湿，一共浇灌4周，4周后收样。每个处理组中每个株系3颗苗，每个处理重复3次。
1.3 测定项目及方法 1.3.1 amt1.1和amt1.3突变体纯合体鉴定amt1.1和amt1.3的基因名称及引物序列见表 1。
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表 1 拟南芥T-DNA突变体株系及引物序列 Table 1 Arabidopsis thaliana T-DNA mutant and primer sequences |
取样生长21 d的拟南芥叶片，采用蔗糖法[20-21]提取基因组DNA，随后进行PCR反应，PCR所用引物序列如表 1所示。反应体系如下：模板DNA 1 μl，正向引物(10 μmol/L)0.4 μl，反向引物(10 μmol/L)0.4 μl，2×Mix rTaq 10 μl，双蒸水8.2 μl，总体积20 μl，混匀后进行PCR反应。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30次循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所用的电泳缓冲溶液为1×TAE，电泳电压为120 V。
利用TaKaRa的RNAiso Plus试剂提取拟南芥野生型与待检测T-DNA插入株系叶片的RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定RNA的浓度。利用Prime-Script TMIIRT试剂盒合成cDNA。然后，利用At4g13500基因的特异引物At4g13500-F(5′- CATCAACCTTAACCTCTCAGACTCCA-3′)和At4g13500- R(5′-GGTTTGGCCCATCAGAATCG-3′)进行RT- PCR检测At4g13500的表达；利用At2g46500基因的特异引物At2g46500-F(5′-CATCAACCTTAACCTCTCAGACTCCA-3′)和At2g46500-R(5′-GGTTTGGCCCATCAGAATCG-3′)进行RT-PCR检测At2g 46500的表达。ACTIN1基因作为内参，ACTIN1引物序列为ACTIN1-F：5′-ACACCAGACATAGTAGCAGAAATCAAG-3′，ACTIN1-R：5′-GAGCCTTACAACGCTACTCTGTCTGTC-3′。扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.3.2 植株生理生化指标测定将外源添加蔗糖处理4周的拟南芥植株收样，并且测定其地上部分的鲜重。参照文献[22-23]，测定叶绿素含量；采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量；采用考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量；采用靛酚蓝比色法测定游离NH4+含量。
称取0.2 g鲜样叶片，放入预冷的研钵中，加入1.5 ml预冷的提取缓冲液，添加少量石英砂在冰上研磨，匀浆收集至1个2.0 ml离心管中，4 ℃，16 000 g离心20 min，然后将上清液转移到新的离心管中测定相关酶活性。提取缓冲液组成：50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L苯甲脒，1 mmol/L ε-氨基乙酸和10 μmol/L亮抑酶肽。采用Magalhaes和Huber[24]方法测定GS和GDH酶活性。
1.3.3 植株矿质元素含量测定用天平称量拟南芥地上部新鲜样品，参照文献[23]，采用凯氏定氮法测定全氮含量；采用H2SO4-H2O2–钒钼黄比色法测定全磷含量；采用H2SO4-H2O2火焰原子吸收分光光度法测定全钾含量；采用干灰化–稀HCl溶解–火焰原子吸收分光光度法[23]，测定钙、镁、铁含量。
1.4 数据分析采用Microsoft Excel 2013软件和SPSS13.0软件进行试验数据的统计和相关性分析，采用Duncan’s检验法进行显著性差异分析。
2 结果与分析 2.1 amt1.1和amt1.3插入纯合体的鉴定图 1中A是拟南芥株系鉴定的示意图。对拟南芥amt1.1和amt1.3株系鉴定结果如图 1中B、D所示，结果显示，该amt1.1和amt1.3突变体有非常清晰的插入特异性扩增条带，产物大约为700 bp。对两个株系DNA样品利用T-DNA插入两端的LP和RP引物进行了PCR扩增，其结果如图 1中C和E所示，野生型样品有预测的1 057 bp和1 101 bp大小的特异PCR产物，而amt1.1和amt1.3株系样品并没有扩增条带，说明amt1.1和amt1.3为纯合的T-DNA插入。对其进行定量PCR，结果如F所示，在amt1.1株系中，几乎检测不到At4g13510，表明amt1.1株系在T-DNA插入的作用下，At4g13510基因完全被敲除。在amt1.3株系中，几乎检测不到At3g24300，表明amt1.3株系在T-DNA插入的作用下，A3g24300基因完全被敲除。
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(A：T-DNA突变体插入片段PCR鉴定模式图；B：col-0和amt1.1的LBb1和LP引物扩增结果；C：col-0和amt1.1的RP和LP引物扩增结果，其中M为Takara DL 2000 DNA Marker，1为col-0，2是amt1.1；D：col-0和amt1.3的LBb1和LP引物扩增结果；E：col-0和amt1.3的RP和LP引物扩增结果，M为Takara DL 2000 DNA Marker，1为col-0，3是amt1.3；F：col-0、amt1.1、amt1.3株系在At4g13510和At3g24300的表达结果，ACTIN1为内参) 图 1 amt1.1和amt1.3拟南芥缺失突变体鉴定 Fig. 1 Identification of amt1.1 and amt1.3 knockout mutants |
从图 2可以看出，CK处理下，col-0和amt1.1、amt1.3三种植株地上部分鲜重没有显著差异。与CK处理相比，T1处理下拟南芥植株的鲜重出现降低，3种植株的降幅分别降低了13.9%、5.2%和3.6%，其中col-0植株的降低幅度最大，远远大于amt1.1和amt1.3植株。与T1处理相比，T2处理下3种植株的鲜重有所增加，增加的幅度依次为4.8%、1.2%和2.1%，其中，col-0植株的增加幅度大于amt1.1和amt1.3植株，表明蔗糖可以缓解高NH4+胁迫对拟南芥生长的抑制，其中对col-0植株的效果更为明显。
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(柱体上方不同小写字母表示相同处理下不同株系植株间差异在P < 0.05水平显著，下同) 图 2 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株地上部分鲜重影响 Fig. 2 Effect of exogenous sucrose on above-ground fresh weight of Arabidopsis thaliana under high NH4+ stress |
从图 3中可以看出，和CK处理相比，T1处理下，col-0、amt1.1和amt1.3植株体内的游离NH4+含量分别增加了34.9%、17.3%和22.5%，其中，col-0的游离NH4+含量增加最为明显；和T1处理相比，T2处理下，游离NH4+含量分别降低了12.5%、5.9%和8.1%。外源添加蔗糖可以在一定程度上减少植物体内游离NH4+含量，相较而言，外源添加蔗糖对高NH4+胁迫下col-0植株缓解能力更强。
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图 3 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株的游离NH4+和叶绿素含量的影响 Fig. 3 Effect of exogenous sucrose on contents of NH4+ and chlorophyll of Arabidopsis thaliana under high NH4+ stress |
叶绿素含量也是反映植物体中氮含量的一个重要指标。从图 3可以看出，和CK处理相比，T1处理下，植物体内的叶绿素含量分别增加了35.1%、26.4%和26.9%，其中，col-0植株的叶绿素含量变化最为明显，和T1处理相比，T2处理下，植株体内的叶绿素含量分别降低了8.5%、5.5%和7.9%。可以看出，外源添加蔗糖可以在一定程度上缓解高NH4+对拟南芥植株的胁迫，其中，对col-0植株的影响更为明显。
2.4 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响植物中碳水化合物是重要的渗透调节物质。由图 4可见，CK处理下，col-0、amt1.1和amt1.3植株的可溶性糖含量并没有明显差异；T1处理下，与CK处理相比，col-0、amt1.1和amt1.3植株的可溶性糖含量分别增加21.5%、12.1%和12.3%，其中col-0植株的增长明显高于amt1.1和amt1.3植株，col-0和amt1.1、amt1.3植株间达到显著性差异。与T1处理相比，T2处理下，col-0、amt1.1和amt1.3植株的可溶性糖含量分别增加17.7%、11.2%和8.4%，col-0植株的增长更为明显，col-0和amt1.1、amt1.3植株间达到显著性差异。
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图 4 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响 Fig. 4 Effect of exogenous sucrose on contents of soluble sugar and soluble protein of Arabidopsis under high NH4+ stress |
和CK处理相比，T1处理下，col-0、amt1.1和amt1.3植株的可溶性蛋白含量都出现增加，分别增加了22.8%、21.8%和23.2%；col-0和amt1.1、amt1.3植株间达到显著性差异。与T1处理相比，T2处理下，3种植株的可溶性蛋白含量出现增加，分别增加了9.2%、15.5%和18.9%。CK和T2处理下，col-0和amt1.1、amt1.3植株间差异不显著。
高NH4+胁迫下，拟南芥植株的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量会出现增加，添加外源蔗糖在一定程度上增加了植株体内可溶性糖和可溶性蛋白含量，从而增加植株的碳水化合物含量，维持细胞内渗透压的平衡，从而提高了植物的抗逆性，同时为氮代谢提供碳源，维持碳氮代谢。
2.5 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株GS和GDH活性的影响GS、GDH是氮代谢中的关键酶，GS是无机氮转化为有机氮的关键酶，GDH是连接碳、氮代谢的关键点。从图 5可知，与CK处理相比，T1处理下，叶片中GS的活性呈现大幅度的降低，col-0、amt1.1和amt1.3植株分别下降了35.1%、35.6%和29.2%，其中col-0植株的降低幅度最大，说明高NH4+胁迫降低了GS的活性，对col-0植株的胁迫最为明显，但是3个株系植株之间并没有显著性差异；与T1处理相比，T2处理下，3个株系植株的GS活性出现不同程度的增加，分别提高了38.1%、44.8%和35.8%，说明外源蔗糖可以提高植株中GS的活性，促进植物中无机氮转化为有机氮的过程。
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图 5 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株的GS和GDH活性的影响 Fig. 5 Effect of exogenous sucrose on activities of GS and GDH of Arabidopsis under high NH4+ stress |
与CK处理相比，T1处理下，col-0、amt1.1和amt1.3植株的GDH活性分别降低了30.6%、17.3%和10.6%，其中col-0植株的降低幅度最为显著，3个株系植株之间达到显著性差异；与T1处理相比，T2处理下提高了植物的GDH活性，3个株系植株分别提高了38.5%、19.7%和12.1%，其中col-0植株的提高幅度最大，表明外源蔗糖可以一定程度上提高植物中GDH活性，对col-0植株的GDH活性提高最为明显。
2.6 外源添加蔗糖对高NH4+胁迫下植株矿质元素含量的影响表 2是外源添加蔗糖后，植物体内矿质元素的含量。从表 2中可知，3个株系植株的氮、磷、钾、钙含量变化规律都为T2>T1>CK。与CK处理相比，T1处理下拟南芥植株的氮含量增加，3个株系分别增加了49.6%、23.9%和25.9%；与T1处理相比，T2处理下，植株氮含量显著增加了20.0%、30.1%和34.8%。对于植株磷含量，T1处理下比CK处理增加了41.7%、32.9%和28.1%；T2处理下，和T1处理相比，分别增加了25.7%、11.1%和1.7%。对于植株钾含量，与CK处理相比，T1处理下col-0、amt1.1、amt1.3植株分别增加了11.2%、16.1%和13.8%；与T1处理相比，T2处理下分别增加了14.0%、9.8%和8.8%。对于植株钙含量，变化幅度和其他元素相比较低，与CK处理相比，T1处理下col-0、amt1.1、amt1.3植株分别增加了1.0%、1.9%和5.2%，T2处理和T1处理相比提高了1.6%、3.8%和1.3%。高NH4+胁迫下，植株的氮、磷、钾、钙含量都表现出不同程度的增加，外源添加蔗糖后，氮、磷、钾、钙含量也都出现不同幅度的提高。
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表 2 外源蔗糖对高NH4+胁迫下拟南芥植株矿质元素含量的影响(mg/g, FW) Table 2 Effect of exogenous sucrose on mineral element contents of Arabidopsis under high NH4+ stress |
植株镁含量的变化规律是CK>T2>T1，与CK处理相比，T1处理下降低了20.3%、8.1%和5.6%，T2处理和T1处理相比，分别提高了1.0%、8.0%和4.0%，高NH4+胁迫下植株镁含量减少，外源添加蔗糖在一定程度上提高了植株镁含量。植株铁含量的变化规律是T1>CK>T2，和CK处理相比，T1处理下，植株铁含量分别增加了37.5%、40.0%和13.7%，T2处理和T1处理相比减少了30.3%、31.4%和36.3%。高NH4+胁迫下植株铁含量增加，外源添加蔗糖在一定程度下减少植株的铁含量。
3 讨论氮是植物生长发育所必需的营养元素[25-26]。而NH4+是植物重要的氮素来源之一，但是其在植株体内的过量累积会对植株造成伤害。植物的鲜重可直观地反映植株生长状况[27-28]。高浓度的NH4+甚至还抑制植物的生长，降低植株的含水量及产量[29-30]。Togoro等[31]试验结果表明，供应NH4+的植株体内非常容易积累大量的游离NH4+，猜测这可能是植株生长受到抑制的原因之一。缺失AMT会导致植物的NH4+吸收能力显著下降[11]。叶绿素含量也是反映植物体中氮含量的一个重要指标。李保海和施卫明[32]报道高NH4+能增加拟南芥植株的叶绿素含量。罗金葵等[33]也报道适当增加NH4+会提高小白菜的叶绿素含量，促进叶面积的生长，随NH4+浓度升高叶绿素含量逐渐变高。本文试验结果也与之符合，高NH4+胁迫下拟南芥植株的鲜重减少，体内游离NH4+积累量增多，叶绿素含量增加。col-0和amt1.1、amt1.3植株相比，受高NH4+毒害更为严重，可能是因为amt1.1和amt1.3植株缺失相关AMT基因，NH4+吸收能力降低，游离NH4+积累较少，从而降低了高NH4+毒害。
本试验中，高NH4+胁迫的同时外源添加蔗糖可以显著缓解高NH4+对植株生长的抑制作用。为了排除因为蔗糖本身营养对植株鲜重的提高，在试验前进行了正常NH4+外源添加5%蔗糖处理，结果显示，该处理植物的鲜重、氮含量和CK处理相比，并没有显著性差异(数据未显示)，因此排除因为蔗糖营养的缘故。现有大量研究表明[34-36]，植株在逆境胁迫下会通过渗透调节来适应环境，而可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质均可作为衡量植物抗逆性的指标。常丽丽等[17]报道外源蔗糖可以缓解高NO3-胁迫对叶用莴苣生长的抑制，提高叶用莴苣的可溶性糖含量，降低NH4+含量；李小刚[37]通过叶面喷施蔗糖提高了NO3 -胁迫下黄瓜幼苗中碳水化合物含量，提高了碳、氮代谢相关酶活性。而本试验中，在T1高NH4+胁迫处理下，拟南芥可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，可能是植物为了更好地适应高NH4+胁迫，通过渗透调节缓解高NH4+胁迫的影响；T2处理下外源添加蔗糖后，拟南芥植株中可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，说明外源蔗糖可以使植株中的碳水化合物含量增加，维持细胞内渗透压平衡，从而提高植株的抗逆性，同时为氮代谢提供碳源，维持碳、氮平衡。
GS在植物体内主要参与无机氮转化为有机氮这一过程，在ATP供能下，催化NH4+和谷氨酸合成可溶性物质[38]。因此，植物GS基因表达受到NH4+的影响，会因植物种类、NH4+浓度及器官的不同而表现出不同的情况，有些植物里面NH4+即可诱导GS基因的表达，增加GS的活性，而在另外一些植物中则会抑制其GS基因的表达，降低GS的活性[39-41]。本试验中，高NH4+胁迫下降低了GS活性，抑制了无机氮转化为有机氮的过程，从而抑制了整个植株的氮代谢过程，外源添加蔗糖可以提高GS活性，缓解高NH4+胁迫对氮代谢的抑制。GDH是连接碳、氮代谢的关键酶[42]，一般在植物体内氨浓度较高时起作用。在本研究中，与T1处理相比，T2处理增加外源添加蔗糖后，GDH活性增加，可能是由于高NH4+胁迫下植株体内NH4+含量增加，而外源蔗糖可以通过提高GDH的活性来转化植株体内的NH4+，提高植株对氮的利用率，减轻NH4+毒性，同时为氨同化提供碳骨架。
盐逆境条件下，植株体内的离子含量发生改变，会对原来的离子平衡关系造成影响，对植株的生长发育产生不利的影响[43]。研究表明，硝酸盐胁迫下，黄瓜叶片中钙、钾含量增加，铁、镁含量降低[44]。本研究结果表明，高NH4+处理下，添加外源蔗糖后，拟南芥植株的氮、磷、钾、钙、镁含量都出现增加，其中氮、磷、钾含量增加比较显著。氮含量增加，表明植株利用氮的能力增强，加快植株对氮的吸收利用，一定程度上缓解了高NH4+毒害。但外源蔗糖不能提高植株铁含量。已有文献报道[45]，高NH4+胁迫会降低植株的含钾量，而本试验中随着NH4+浓度的增加，植株含钾量也随之增加，推测可能是因为本试验测定的是以鲜重为基础的含钾量，高NH4+降低了植株的含水量，因此植株鲜重的含钾量增加。高NH4+胁迫显著抑制了拟南芥的生长，影响了矿质元素在植株中的含量，外源蔗糖可缓解高NH4+胁迫对拟南芥生长的抑制作用，并提高了各矿质元素的含量，说明外源蔗糖可通过影响矿质元素的吸收积累，维持离子之间的平衡，减轻高NH4+胁迫对拟南芥的毒害作用。
4 结论NH4+胁迫显著抑制了拟南芥植株的生长，外源添加蔗糖可以缓解高NH4+胁迫的抑制，这可能是由于外源蔗糖可以提高植株体内碳水化合物的含量，维持细胞内渗透压平衡，从而提高植株的抗逆性；另外，外源蔗糖处理增加了GS和GDH活性，加速氨同化作用，减少植株体内游离NH4+含量；其还可以通过矿质元素的吸收积累，减轻高NH4+胁迫对拟南芥的毒害作用。
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