2020, Vol. 52
2. 中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081;
3. 哈尔滨市农业科学院生物中心，哈尔滨 150028
土壤有机质(soil organic matter, SOM)是生态系统中非常重要的物质，它不仅对土壤团聚体结构和透水性有改善作用，对土壤物理化学和生物学以及“温室效应”有调控作用，而且对重金属的吸收与转化也有促进作用[1-3]。SOM对陆地生态系统(尤其是生物圈和大气圈)的可持续发展有决定作用[4]，研究SOM的含量变化可以为土壤质量、土地利用以及土壤健康评价等方面提供一定的理论依据，同时为全球气候变化和碳氮循环研究提供一定的数据基础[5]。
但是，Stevenson[6]研究发现，SOM降解慢并存在滞后性，研究其短期含量变化实际意义不大，而土壤活性有机质(labile organic matter，LOM)的含量虽然较少，其对环境条件的变化比SOM更敏感，是生态系统管理措施的早期且快速的指标。土壤LOM指的是土壤有机质的活性部分，其在土壤中具有较高的有效性和一定的溶解性，容易被土壤微生物氧化、矿化，而且对植物的养分供应有最直接的作用[7]。土壤LOM在生态系统中至少起着3方面作用：①它对土壤物质循环具有表征意义，有助于土壤质量的评价；②它对土壤结构有一定的稳定作用，对团粒结构稳定性的维持具有重大意义；③它是植物的养分库，对养分周转有重要作用，能够提供氮、磷、硫等植物需要的养分。因此，土壤LOM具有很大的研究潜力和研究价值，是近些年来土壤科学工作者研究的焦点[8]。
土壤LOM通过物理、化学、生物学[9]以及联合分组[10]的方法可以分离出不同的组分，诸如：①物理组分：轻组有机质(light fraction organic matter，LFOM)、颗粒有机质(particulate organic matter，POM)、大团聚体有机质(macro-aggregate organic matter，MAOM)；②化学组分：酸碱提取有机质(富啡酸，fulvic acid，FA)、溶解性有机质(dissolved organic matter，DOM)、酸水解有机质(acid hydrolyze organic carbon，AHOC)和易氧化有机质(readily oxidized organic matter，ROOM)；③生物学组分：微生物生物量碳、氮(microbial biomass carbon and nitrogen，MBC、MBN)和潜在可矿化碳、氮(potentially mineralizable carbon and nitrogen，PMC、PMN)；④联合分组组分：物理保护有机质(iPOM)和游离活性有机质(cPOM、fPOM)[11]。
针对土壤LOM组分的数量，学者们已经开展了广泛的研究[12-17]。但由于土壤LOM组分的数量测定的分析方法至今还没有完全统一，加之每次试验外部条件的控制不可能完全相同，分析结果通常存在不确定性和难比较性，需要对土壤LOM组分的质量(分子结构)进行深入研究。光谱分析不仅可以了解LOM内部分子的结构特性，而且具有操作简便、分析速度快、选择性好、灵敏度高和所需样品量少等优势[18]，越来越受到科研工作者的关注。各种结构的物质都有其独一无二的特征光谱，光谱分析是利用光谱学的原理(特征光谱)和实验方法来确定所测物质的结构及其化学组成和相对含量(化学成分分析)的方法[19]，它的基础理论为原子光谱学和分子光谱学。光谱法主要分为吸收光谱(物质粒子对光的吸收)和发射光谱(光源所发出的光谱)，吸收光谱是在连续发射光谱的背景中所呈现出的暗线[20-21]。常见的吸收光谱有紫外–可见吸收光谱、红外吸收光谱和原子吸收光谱等，而常见的发射光谱有荧光发射光谱和原子发射光谱等[22]。
对于土壤LOM组分来说，由于生物学分组分离出的组分是气态的已知成分，因此没有必要进行光谱分析，而其他3种分组方法分离出的组分并不是单一的物质，而是混合物，因而有必要对它们进行光谱分析，探究其内部物质的结构组成。本文对研究土壤LOM内部结构的紫外–可见光谱(ultraviolet-visible spectrum，UV-vis)、傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectrum，FTIR)、三维荧光光谱(three-dimensional fluorescence spectrum，3DEEM)和固态核磁共振碳谱(solid-state 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy，13C-NMR)分析技术进行了详述，并提出了每种土壤LOM组分所适宜的光谱分析方法，以期为研究解析土壤LOM的数量和质量变化规律提供技术参考。
1 紫外光谱 1.1 紫外光谱的基本原理紫外和可见吸收光谱是由分子中价电子的跃迁所产生的，分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级的过程中吸收了相应波长的光[23]。紫外吸收光谱的波长范围是100 ~ 400 nm，其中，100 ~ 200 nm为远紫外区，200 ~ 400 nm为近紫外区，一般的紫外光谱是指近紫外区，也就是UV-vis光谱[24]。
1.2 紫外光谱分析方法的优缺点UV-vis光谱具有需样量小、操作简便、样品破坏少和灵敏度高等优势。但是，在对被测物质进行分析时主要振动键有时会结合，而且由于在近紫外区只能观察到π→π*和n→π*跃迁，因此，它只适用于具有不饱和结构的化合物[25]。
1.3 紫外光谱分析方法的适用对象和条件UV-vis光谱分析方法可用于DOM的半定量分析，用来揭示土壤和水体中有机质的结构组成与性质[26]。对于土壤中的活性有机质组分，利用化学分组得到的FA、AHOM、DOM和ROOM的液态物质都可以用UV-vis光谱测定其结构特征，以下把这些组分统称为“液态有机质”。
1.4 紫外光谱分析方法的研究进展和应用利用UV-vis光谱研究DOM的π-π共轭双键在紫外光区的吸光性，可以揭示有机质结构以及判定其来源[27-28]，因此UV-vis光谱被广泛用于土壤DOM的研究[29-31]。李璐璐等[29]利用新鲜沉积物质的降解程度的光谱斜率之比(SR)，对三峡库区典型消落带的土壤和沉积物中DOM的光谱特性进行了研究，揭示出表层沉积物的芳香性、腐殖化程度和疏水性要明显高于深层土壤中的DOM。研究认为，土壤中的紫外光谱在不同地理条件下不同，而在同一地点因植被的不同也有所差异[30-31]。
此外，DOM的分子量大小、含量组成、疏水性、腐殖化、团聚化、取代基复杂程度等性质，可以通过UV-vis光谱特定波长下的紫外–可见吸光度值和两个特定波长下的吸光度比值表示(表 1)[32-33]。Nishijima和Speitel[34]通过对DOM在254 nm处的紫外光谱研究发现，在浓度一致时，DOM的吸光度值和芳香性碳含量与腐殖化程度呈正相关，即其比值越高，所测物质芳香性越强、腐殖质类物质含量越高。已有研究认为，DOM在280 nm处的紫外吸光度与分子量大小呈正相关[35-36]。然而，土壤活性有机质的其他化学组分(FA、AHOM和ROM)在UV-vis光谱上应用研究得很少，有必要加强紫外光谱分析在土壤活性有机质组分研究上的应用。
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表 1 紫外–可见光谱特征参数的特性及表征意义 Table 1 Characteristics and representational significances of UV-vis spectral parameters |
任何样品都可以得到一张红外光谱，基于被测物质红外光谱中吸收峰的位置、强度和形状，能够确定其分子中含有哪些基团，从而推断其分子结构[42]。土壤LOM中最常用的红外光谱是FTIR，连续波长的光源照射红外样品后，样品中的分子会吸收某些波长的光，检测器将检测到的未被吸收的光信号经过模数转换，再经过傅里叶变化，即得到所测样品的单光束光谱[42]。在红外光谱中，被吸收的光的波长或波数位置会出现吸收峰，某一波长的光被吸收得越多，透射率越低、吸收峰越强，当样品中分子吸收多种波长的光时，所得的谱图中就会出现很多吸收峰[42]。表 2是土壤有机质的红外光谱特征吸收峰的归属信息。
2.2 红外光谱分析方法的优缺点20世纪70年代，FTIR光谱的出现为红外光谱在土壤有机质结构测定中的研究提供了强有力的保障[42]。然而，由于红外光谱很复杂，至今还不能完全得到所有有机质的内部分子结构信息，但是它所提供的现有信息已经对探究土壤有机质的结构起到了至关重要的推动作用[43]。FTIR光谱具有灵敏度高、所需样品少、破坏性小、波数准确、重复性好、信噪比好、分辨率高等优点[44]，其不仅可以分析超薄薄膜(纳米级)的样品，而且利用红外光谱附件(例如红外显微镜)可以分析微克级甚至纳克级的样品[42]。此外，FTIR光谱不仅可以用于定性和定量(半定量)分析，还可以对未知物的结构组成进行剖析；其应用范围特别广泛，固液气各种形态、单一组分的纯净物和多种组分的混合物都可以用FTIR光谱测定[45]。
2.3 红外光谱分析方法的适用对象和条件对于土壤LOM的组分来说，物理分组和联合分组得到的都是固态有机质，而化学分组分离的是液态有机质，虽然上文中提到FTIR对物质的各种形态都可以进行分析，但是液态有机质在FTIR上的测试效果并不理想，最理想的物质形态为固态，这是因为水是强极性溶剂，其体系中含有大量的氢键，水溶液中的溶质会发生水化作用，使得溶质的光谱发生变化，最终导致水溶液中溶质的光谱和固态的光谱会有很大的差异[42]。因此，如果不是特意研究水溶液状态下溶质的光谱，就应该将水分除去，最后测试固态样品的光谱。去除水分的方法有自然晾干、低温(40℃)烘箱烘干、氮气吹干和在干燥器中除水，切忌不要用加热的方法或是真空泵除水，以防止挥发性大的物质损失掉或样品发生化学变化[46]。
2.4 红外光谱分析方法的研究进展和应用红外光谱能够得到土壤的不同组分(如总碳、有机碳、无机碳、活性有机碳和可用碳等)信息[46-47]，可以预测土壤有机质物理分组的团聚体不同粒径以及POM不同大小的结构组成[47]。任雅阁等[48]利用红外光谱技术的研究发现，不同粒径的土壤水稳性团聚体中的有机质组成一致，其丰度有差别；微团聚体中稳定的芳香碳趋多，而大团聚体有机碳中含有活性较高的碳(如脂肪碳、多糖碳等)。
红外光谱能够解析不同耕作措施下土壤FA的结构特征，土壤FA主要以脂肪族碳(烷基碳和烷氧碳)为主，随着土壤深度的增加，免耕促进土壤FA中羰基、羧基和酚羟基含量的增加，降低甲氧基和醇羟基的含量，使其芳构化程度和氧化程度增强[49]，2920/1620的比值最低，脂肪链烃分支程度最高[50]；而在垄作措施下，土壤FA的芳香性较弱、脂族性较强[50]。同时，利用红外光谱也可以揭示施入秸秆后，土壤FA的结构变化。土壤中施入玉米秸秆后，FA的羧基含量减少，并且由羧酸盐的形式向游离的羧基形式逐渐过渡，降低了芳香碳的含量、氧化程度和芳香度，增加了酰胺成分和脂族链烃结构成分，最终使FA的分子结构趋于简单化[51]。随着水稻秸秆燃烧次数的增加，土壤FA中含有脂肪族的C-O和羟基碳含量也增加[52]。
此外，红外光谱在不同的信号峰区间能够鉴别出DOM中不同的基团大小，同时也可以用于不同样本间的比较。DOM的主要组成物质是碳水化合物，多糖成分较多，芳香族不饱和烷基链烃物质少且支链短，分子结构简单[53-54]。倪文海等[55]利用FTIR光谱研究水稻秸秆腐殖化过程中的DOM结构变化特性，发现DOM的成分变化呈阶段性发展，最初多为小分子物质的降解，中期是纤维素分解，最后是腐殖化时期，因此DOM的分子结构逐渐从简单到复杂化。Santos等[56]还将FTIR光谱应用到雨水DOM的探索上，研究表明，雨水中的脂肪族C-Hx官能团多于自然水体。因此，应用红外光谱分析方法将为深入探讨有机质活性组分及其结构的变化提供更多的信息。但是，基于我们的认知，发现LFOM、AHOC、ROOM和联合分组的组分在红外光谱上的应用不多，今后应该加强这些组分在红外光谱上的探讨。
3 荧光光谱 3.1 荧光光谱的基本原理分子荧光光谱是利用某些物质分子受光照射所发生的荧光特性和强度，进行定性或定量分析的检测方法[57]。其主要原理是：当被测物质吸收了特征频率的光子后，由最初的基态能级跃迁至电子激发态的各个不同振动能级，激发态分子经与周围分子撞击而消耗了部分能量，迅速下降至第一电子激发态的最低振动能级，并停留约10–9秒之后，直接以光的形式释放出多余的能量[58]。
3.2 荧光光谱分析方法的优缺点荧光光谱包括荧光发射光谱、荧光激发光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱(three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy，3DEEM)等[58]。荧光发射光谱是在扫描过程中保持激发光的波长和强度不变，让荧光物质所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，以荧光波长和荧光强度分别为横纵坐标所作出的谱图[59]。荧光激发光谱是在扫描过程中保持发射光的波长和强度不变，让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光，而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，以激发光波长和荧光强度分别为横纵坐标所绘制的谱图[59]。同步荧光光谱是在扫描过程中保持激发光与发射光的波长差不变，它与前两种相比，可以提供更多的官能团和结构信息，但是其受拉曼散射的影响程度很大，导致检测的选择性差、灵敏度低[59]。3DEEM可以同时获得激发波长和发射波长的荧光强度信息，是一种有用的光谱指纹技术[60]，与前面三者相比，其具有灵敏度高、破坏性和所需样品量小、操作简单、选择性好、信息量丰富、检测线低等优势[18, 58, 60]，以下主要对3DEEM进行介绍。
3.3 荧光光谱分析方法的适用对象和条件3DEEM和UV-vis光谱的适用范围类似，都是适合测定液态有机质的化合物，如上述1.3中提到的利用土壤有机质化学分组所得到的液态组分(FA、AHOM、DOM和ROM)均可以用3DEEM进行分析。
3.4 荧光光谱分析方法的研究进展和应用3DEEM的研究有普通寻峰法(peak picking)、平行因子分析(PARAFAC)和荧光区域积分(FRI)等方法。普通寻峰法基于激发和发射波长分成的5个区域(表 3)所代表的不同物质种类可以追踪活性有机质的来源和比较腐殖化程度的大小[61-62]。PARAFAC和FRI技术可以克服所测样品中单个荧光组分的异质性困难[63]，其分析简便并且适用于多变量的数据分析，PARAFAC将荧光光谱(EEM)分解成各自单独的荧光成分，并提供相对完整的有机质组分(例如FA)的数据分析[64]；FRI能够分析每个激发发射区域下的体积积分，并分析从EEM得到的所有波长的相关荧光强度的光谱数据[65]。
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表 3 激发和发射波长范围的EEM峰的位置归属和特征描述[61-62] Table 3 Locations and descriptions of EEM peaks in ranges of excitation and emission wavelengths |
3DEEM的普通寻峰法适用于研究非根际和根际(如玉米和大豆)土壤DOM的结构和组分[66-68]：苏打盐碱型水稻土中类富里酸、类腐殖物质以及含有不饱和双键的芳香族化合物含量随种植年限而增加；施用有机肥有利于增加水稻土中DOM的质量分数[69]，中国东部土壤DOM具有相似的荧光光谱特征[70]。应用EEM-PARAFAC和FRI方法，可以研究河口环境中有色溶解有机物(CDOM)[63, 71]、填埋型城市固体废弃物中的水提取有机物(DOM)[72]以及土壤、堆肥中的DOM和FA的来源及腐殖化程度[62, 73]。Wu等[74]利用EM-PARAFAC和EEM-FRI两种方法对DOM的物质组成进行划分，能够快速准确地评价城市生活垃圾的生物学稳定性。谷思玉等[75]利用EEM-PARAFAC技术对FA组分进行分析，揭示出盐渍土施用有机肥后主要增加生物可利用富里酸组分的比例，其次可增加陆生来源富里酸组分的比例。Zhao等[62]同样应用EEM-PARAFAC技术对不同材料的堆肥中FA组分的含量和分布进行研究，表明其腐殖化程度存在明显差异的原因是不同物料堆肥中的FA组成相似但其各组分的分布不同。杨威衫等[76]应用EEM-PARAFAC技术揭示了草甸土DOM的来源、组成和性质对不同海拔气候条件的响应特性。
由此可见，对于土壤中的活性有机质组分，土壤中DOM和FA组分应用荧光光谱进行研究的很多，但是，尚无利用化学分组提取出的AHOC和ROC进行3DEEM的研究，而利用该项技术研究这两个活性有机碳组分的来源，将为深入剖析土壤有机质的结构特征提供有价值的信息。
4 核磁共振 4.1 核磁共振的基本原理20世纪40年代，鉴定化合物结构的核磁共振(NMR)技术开始发展起来[77]。原子核在外加磁场中发生能级裂分，在与外磁场垂直的方向上加交变电场，当射频频率等于进动频率时，发生共振，低能态原子核吸收射频能量，跃迁至高能态，称为核磁共振[78]。产生核磁共振有3个必要条件：①原子核为磁性原子核(自旋量子数I≠0)；②磁性原子核处于强的外磁场中发生能级裂分，能级差与磁场强度成正比；③辐射的射频能量等于两个能级之间的能级差[79]。
4.2 核磁共振分析方法的优缺点NMR是一种无损检测技术，样品预处理简单，谱图内容丰富，可以全面地提供被测物质的成分信息[78-80]。此外，NMR由于其分析测定技术的多样化，可以分析固态和液态样品[81]。鉴于此，NMR技术在土壤科学(有机质)、植物科学(生物多样性)和生命科学(医药、生理和发育)等领域广泛应用[82-86]。但是，在被测物质检测时，有时不同功能组的光谱峰由于重叠而不能区分开，其使用和分析成本也很高；而且，检测要求必须是纯物质，对混合物检测前必须进行萃取分离等预处理，这就对科研工作者处理土壤样品的技术提出了更高的要求[78]。
4.3 核磁共振分析方法的适用对象和条件SOM检测中常用的NMR技术有1H-NMR、液态13C-NMR和固态13C-NMR。1H-NMR是发展最早且最简单的一维氢谱，具有灵敏度高、信息丰富、技术成熟、参数选择简单和规范性强等优势[27]。SOM成分很复杂(如土壤腐殖质中包括富啡酸、胡敏酸和胡敏素等多种多样的有机化学成分)，利用1H-NMR谱图可以快速地鉴定这些成分，也可以用于物质的指认和追踪测量等方面，为科学试验提供指示性信息。但是，1H-NMR只能测定液态样品，由于样品中残留的水可能会干扰试验结果，其检测的谱图具有较差的直观性和较低的分辨率[87]。表 4是1H-NMR图谱的划分区域及其具体的结构信息。
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表 4 土壤有机质1H-NMR图谱的划分区域及其结构信息[9, 72] Table 4 Division of 1H-NMR spectrum of SOM and its structural information |
13C-NMR可以检测液态和固态的物质，液态13C-NMR具有较大的谱宽和很高的分辨率，可以指示更明确的信息，这为复杂体系的土壤样品中信号的归属提供了有力支撑[88]。直到20世纪70年代，固态13C-NMR分析技术才开始应用于土壤学领域[89]，尽管其固态物质的偶极-偶极相互作用很强，分辨率没有液态13C-NMR高，但是，固态13C-NMR技术的预处理简单方便，不需要用化学或者其他破坏内部结构的方法提取有机物质，谱图内容丰富，能够全面地提供被测物质的原始成分信息[78]。表 5是13C-NMR图谱的划分区域及其具体的结构信息，DOM各组分的1H和13C图谱可参考代静玉等[92]的研究。
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表 5 土壤有机质13C-NMR图谱的划分区域及其结构信息[89-91] Table 5 Division of 13C-NMR spectrum of SOM and its structural information |
基于上面的分析，对于土壤活性有机质的不同组分来说，经过物理分组和联合分组分离出的固态活性有机质组分可以直接通过固态13C-NMR检测，而经过化学分组提取出的液态活性有机质组分则要去除水分呈固态后再通过固态13C-NMR检测，务必保证所提取的土壤活性有机质组分的杂质降到最低，这与红外光谱的适用范围相似。
4.4 核磁共振分析方法的研究进展和应用利用固态13C-NMR分析方法可以揭示出不同粒径团聚体组分的结构差异。通常情况下，随着团聚体粒径的减小，有机碳中的烷氧碳所占比例降低[93-94]，烷基碳和羧基碳相对含量逐渐增高[95]，但是芳香碳所占比例在不同土壤中变化不一致，有的增加[96]，有的减少[97-98]。这可能是由于植物残体有机碳的组成部分50% ~ 70%为烷氧碳[99]，外源植物残体进入土壤后，优先聚集在大团聚体的有机碳中，大粒径的团聚体比微团聚体的植物分解程度低，随着植物残体的分解程度增加，逐渐转移至小粒径的团聚体有机碳中[88]；相对来说，随着分解过程的增加，选择性保留的有机物质(如软木脂和角质等)和微生物再次合成的物质会在小粒径的团聚体中积累，这导致了烷基碳和羧基碳的比例增加；芳香碳比例减少的原因可能是在分解初期，大团聚体中植物残体来源的木质素选择性保留的结果[100]。
此外，利用固态13C-NMR技术也可以对LFOM、POM和DOM的内部结构进行解析。LFOM的来源主要是植物，其含有丰富的脂肪酸、软木脂、木质素二聚物、固醇和油脂，且LFOM对木质素进行选择性富集的时候，烷氧碳含量同时减少[101-102]。不同土地利用方式下，LFOM中烷氧碳的比例约为50%，烷基碳和芳香碳次之；LFOM比闭蓄态有机质中的烷氧碳多，而烷基碳少[96, 103]。江西水稻土的POM是由烷氧碳、烷基碳、芳香碳和羰基酚基碳组成，其所占比例分别为46% ~ 53%、20% ~ 26%、15% ~ 21%和6%[104]。DOM中腐殖酸和富里酸的组成大约为25% ~ 50%, 其他的组分主要是多糖、蛋白质和亲水性有机酸[105]。目前对于土壤活性有机质的液态组分应用NMR技术研究的很少，今后可以尝试这些组分在NMR上的应用，以期为土壤活性有机质不同状态的组分研究提供全面的技术参考。
5 结语与展望综上所述，土壤LOM常用的光谱分析方法有UV-vis、FTIR、3DEEM和固态13C-NMR，基于各种分析方法的优势，总结出每种活性有机质组分所对应适用的光谱分析方法(图 1)以及作用和劣势(表 6)。鉴于以上每种光谱的作用和劣势，我们认为今后的研究应该从以下几个方面开展。
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图 1 土壤各个活性有机质组分所适用的光谱分析方法 Fig. 1 Spectral analysis methods for soil LOM components |
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表 6 土壤活性有机质光谱分析方法的作用和劣势 Table 6 Roles and disadvantages of spectral analysis methods of soil LOM |
1) 将光谱学的定性、(半)定量分析和物理化学传统方法的定量分析有机结合，共同探讨土壤LOM组分的数量和质量(内部分子结构)变化规律，并根据不同的研究目的筛选切实可行的光谱分析技术，多种分析技术相互印证，才可能得出更为准确、详实的结果。
2) 将光谱分析方法与化学计量学结合，利用各种模型深入、全面、准确地探讨土壤各活性有机质的结构信息。
3) 要真正了解有机化合物的分子量和官能团碎片的结构，腐殖化过程中所形成的复杂化合物在聚合、缩合和多环芳烃共轭等性质方面的信息，以及物质内部原子在空间分布状况结构的真正三维图像，其他技术，诸如热解-气相色谱法(pyrolysis-gas chromatography，Py-GC) [115]、质谱(mass spectrometry，MS)[116]、拉曼光谱(raman spectroscopy，RS)[117]、X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)图谱分析[118]、扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)、透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)和电子力显微镜(atomic force microscope，AFM) [119]，也是研究的有力工具。
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2. Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;
3. Department of Biological Center, Harbin Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150028, China