2021, Vol. 53
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 西北农林科技大学资源环境学院, 陕西杨凌 712100
木质素是构成植物木质部的复杂高分子化合物，是仅次于纤维素的第二大丰富的植物源材料。作为一种复杂的交叉连接的多酚聚合物，木质素主要由3种类型的对羟基苯基丙基醇(单体醇)组成，即松柏醇(愈创木基型)、芥子醇(紫丁香基型)和香豆素醇(对羟基苯基型)。木质素应用广泛，可作环氧树脂、橡胶及热塑性塑料等的添加剂、高分子原料、动物饲料添加剂以及土壤的改良剂和修复剂。研究发现，木质素能够提高土壤有效磷含量，促进无机磷向有机磷的转化，提高磷肥利用率[1]。木质素还可以作为共代谢底物刺激土壤微生物促进多环芳烃的降解[2]。在土壤中，木质素的降解依赖于微生物作用。一般认为，真菌首先解聚木质素，所产生的酚酸类单体化合物经由细菌进行矿化[3]。酚酸类物质属于自毒物质，可能产生植物化感作用，抑制植物生长[4]。
蚯蚓是常见的土壤动物，被誉为土壤生态系统的“工程师”，在有机质分解和养分循环、土壤理化性质的改良、土壤微生态平衡等方面均有促进作用。许多研究表明蚯蚓能缓解植物生长障碍。例如，蚯蚓能促进酚类物质的降解，抑制化感作用，改善草莓的连作障碍，这种调控主要通过微生物实现[5]；蚯蚓分泌的黏液能促进土壤污染物的去除，同时促进黑麦草生长[6]；蚯蚓还可以与菌根真菌互作，改善植物营养和生长，并协同修复土壤重金属[7]。
黑麦草(Lolium perenne L.)，属禾本科黑麦属，是一种优质的饲草，也常用于污染农田土壤的修复。前期研究表明，木质素对黑麦草的生长有抑制作用[2]，不利于其实际应用。为解决这一问题，有必要利用包括投加蚯蚓在内的各种手段，缓解黑麦草生长障碍，而木质素和蚯蚓对土壤生态系统的作用，也将在土壤微生物群落响应中得到反映。为此，本研究设立了盆栽试验，以黑麦草为模式植物，研究木质素、蚯蚓及其联合作用对植物生物量的影响，并通过qPCR和高通量测序深入解析木质素、蚯蚓及其联合作用对土壤微生物丰度、群落组成的影响，以揭示蚯蚓缓解木质素对植物生长胁迫的作用及其对相关土壤微生物群落的效应。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤：采自江苏省南京市某钢铁厂附近的农田表层土壤。土样放置室内自然风干，过2 mm筛。土壤的基本理化性质为：pH 6.84，有机质12.7 g/kg，全氮1.3 g/kg，全磷0.57 g/kg，全钾19.3 g/kg。
供试植物：黑麦草(Lolium perenne L.)，种子购于江苏省南京市玄武区东郊种业公司。
供试蚯蚓：威廉环毛蚓(Pheretima guillelmi)，购于江苏省句容市某蚯蚓养殖场。
化学试剂：木质素购于Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
1.2 试验设计盆栽试验于中国科学院南京土壤研究所玻璃温室内进行，设置4个处理，见表 1，每个处理4个重复。试验采用底部有孔的塑料盆，便于水分沥出，盆下放置托盘，收集沥出的水分。加入土壤之前，将孔径1 mm的尼龙网铺在盆底，以防蚯蚓游出。每盆包含2 kg土壤，木质素加入量为8 g/kg，充分混匀后加入盆中，加水调节土壤含水量至田间持水量的60%。加入威廉环毛蚓6条/盆，未钻入土壤的用其他蚯蚓取代，保证每条蚯蚓健壮。黑麦草种子用温水浸种24 h，经催芽后分别穴播于上述盆钵中，每盆20粒。出苗1周后间苗，每盆留苗10株。温室培育3个月后收集植物样品和土壤样品。每盆用不锈钢土钻随机取5个点土样混合，并将土样置于-20℃保存以供微生物分析。
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表 1 试验处理 Table 1 Experimental Treatment |
植物生物量采用常压恒温干燥法测定[8]。
1.3.2 土壤DNA的提取采用FastDNA Spin Kit for soil试剂盒(MP Biomedicals, Solon, USA)提取土壤DNA，每个样品约0.5 g，微量分光光度计(NanoDrop 2000)和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的浓度和质量。DNA经10倍稀释后用于下游分析，以防共提取杂质的干扰。
1.3.3 定量PCR采用定量PCR方法测定土壤中细菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因的数量。引物分别是515F/907R[9-10]、nu-SSU-0817-5’/nu-SSU- 1196-3’[11]。定量PCR采用SYBR Green方法，每个样品重复3次。克隆目标基因提取质粒后，测定其浓度并计算拷贝数作为标准品，进行梯度稀释、测定后绘制标准曲线(拷贝数范围102 ~ 108 copies/μl)，细菌16S rRNA基因标准曲线的R2=0.997，扩增效率117%，真菌18S rRNA基因标准曲线的R2=0.995，扩增效率99%。
1.3.4 高通量测序及数据分析采用通用引物515F/907R扩增细菌16S rRNA基因片段，ITS1f/ITS2[12]扩增真菌ITS基因，其中正向引物序列中包含5 bp的条形码(barcode)序列。将PCR扩增后的产物用2% 琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后建立文库，采用Illumina MiSeq系统进行双向高通量测序(上海美吉)。基于QIIME2分析平台进行高通量数据分析。序列经拼接、比对后在97% 相似性水平划分操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，通过与Silva数据库(https://www.arb-silva.de/)比较确定细菌序列的系统学分类，通过与Unite数据库(http://unite.ut.ee/)比对确定真菌序列的系统学分类。
1.4 数据处理本试验数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析(ANOVA)，用R Studio的vegan包计算布雷距离(bray distance)进行非度量多维尺度分析(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)，采用pheatmap包(https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)进行热图分析，用Graphpad Prism 5分析作图，图中数据均为平均值。
2 结果与分析 2.1 黑麦草生物量经过3个月的温室培养，各处理黑麦草的生物量如图 1所示。R处理黑麦草的生物量平均为3.91 g/盆；添加木质素(RL处理)对黑麦草生长的抑制作用明显，植物生物量平均为2.32 g/盆，抑制率为41%；添加蚯蚓(RE处理)显著促进黑麦草的生物量，平均达8.70 g/盆；RLE处理中，蚯蚓部分解除了木质素的抑制作用，植物生物量平均达到6.22 g/盆，显著高于R处理。
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(图中不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)；下同) 图 1 黑麦草生物量 Fig. 1 Dry biomass of Lolium perenne L. |
定量PCR测定结果(图 2)显示，4个处理细菌16S rRNA基因拷贝数在1.21×109 ~ 2.93×109 copies/g。其中R处理细菌16S rRNA基因丰度为2.11×109 copies/g，RL处理明显降低了细菌的基因拷贝数，RE与R处理的基因拷贝数基本相同，表明单一蚯蚓处理对土壤细菌丰度没有产生显著效应；RLE处理与RL处理相比，土壤细菌基因拷贝数显著增加，达到2.93×109 copies/g，是RL处理的2倍。
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图 2 细菌(A)、真菌(B)的基因丰度 Fig. 2 Gene abundances of bacteria (A) and fungi (B) |
从图 2还可知，4个处理真菌18S rRNA基因拷贝数在1.64×106 ~ 1.11×107 copies/g，趋势和细菌基本保持一致。木质素明显降低了真菌的基因拷贝数，而蚯蚓增加了真菌的基因拷贝数，从R处理的6.36×106 copies/g增加至RE处理的9.04×106 copies/g。木质素、蚯蚓共存下真菌18S rRNA基因丰度的增幅更加明显，RLE处理的基因拷贝数是RL处理的6倍之多。
2.3 细菌群落在细菌16S rRNA基因的高通量测序中，RL处理4个重复中有1个未能成功扩增，其余15个样品共获得43万条序列，单个样品的序列数在9 309 ~ 43 850，在97% 序列相似性水平获得9 277个OTU。每个样品随机抽样9 000条序列做OTU表，在此基础上对土壤细菌群落组成进行分析。结果显示，经过3个月的温室培养，各处理的土壤细菌群落结构出现了显著变化(图 3A)。R与RE处理聚集在一起，RL与RLE处理聚集在一起，表明木质素对细菌群落结构产生了较大的影响，而蚯蚓对细菌群落结构的影响相对较小。
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图 3 细菌(A)、真菌(B)群落的NMDS分析 Fig. 3 NMDS analyses of bacteria (A) and fungi (B) communities |
对相对丰度大于2% 的细菌门进行分析(图 4A)，结果显示，在R处理中，土壤中的优势细菌为γ-变形菌门(Gamma Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、α-变形菌门(Alpha Proteobacteria)，分别占比32.00%、17.09%、16.31%、9.45%；与R处理相比，添加木质素明显改变了细菌门水平的组成，促进了α-变形菌门、δ-变形菌门(Delta Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度，降低了γ-变形菌门Gamma Proteobacteria、酸杆菌门、拟杆菌门的相对丰度；而添加蚯蚓主要促进了α-变形菌门、酸杆菌门和蓝藻(Cyanobacteria)的相对丰度，降低了拟杆菌门的相对丰度；RLE处理与RL处理相比，γ-变形菌门、酸杆菌门的相对丰度有一定的升高，厚壁菌门有一定的降低。
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图 4 细菌(A)、真菌(B)门水平的相对丰度 Fig. 4 Relative abundances of bacterial (A) and fungal (B) at phylum level |
为探究各处理的作用特征，在科水平对相对丰度大于1%，且处理间具有显著性差异的细菌做热图分析(图 5)。根据细菌对木质素的响应，R与RE、RL与RLE处理分别聚为一类，比较可见，蚯蚓对细菌的影响不大，主要显著富集了酸杆菌的Blastocatellaceae、Pyrinomonadaceae和变形菌的Caulobacteraceae、Rhizobiaceae、Burkholderiaceae等。木质素导致多个科，如拟杆菌中的Lentimicrobiaceae、Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17，酸杆菌中的Koribacteraceae，变形菌中的Sphingomonadaceae、Methylophilaceae、Archangiaceae、Geobacteraceae，厚壁菌中的Christensenellaceae等丰度显著增加。
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图 5 科水平各处理的相对丰度热图 Fig. 5 Heatmap of relative abundance at genus level under different treatments |
进一步分析各处理中相对富集程度较高的类群，结果如图 6所示。Ignavibacteriales/Other、Lentimicrobiaceae、Methylophilaceae、Prolixibacteraceae、Christensenellaceae、Bacteroidetes vadinHA17、Koribacteraceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae和Anaerolineaceae在R、RE处理中的相对丰度极低，在RL处理中均有较高的相对丰度，而在RLE处理中的相对丰度虽低于其在RL处理中的相对丰度，但大多高于仅加入蚯蚓的RE处理，仍然显示出木质素的作用。
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图 6 潜在的木质素降解菌在各处理中的相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of potential lignin-degrading bacteria under different treatments |
在真菌18S rRNA基因的高通量测序中，16个样品一共获得181万条ITS基因序列，单个样品的序列数为35 534 ~ 73 266，在97% 序列相似性水平获得1 780个OTU。每个样品随机抽样35 534条做OTU表，在此基础上分析土壤真菌的群落组成。结果显示，经过3个月的培养之后，真菌的群落结构发生了一定的变化(图 3B)，R处理与RE处理有一定的分离，表明蚯蚓对真菌群落产生了一定的影响；RL处理与R处理相距较远，除了一个异常点，提示木质素对真菌群落也同样产生了较大的影响；而RLE处理却与R处理聚集在一起，与R处理的群落结构类似。
将相对丰度大于1% 的真菌做堆积图(图 4B)，可见，在R处理中主要的门是子囊菌门(Ascomycota)、Mortierellomycota、担子菌门(Basidiomycota)，分别占比75.01%、10.78%、6.25%。木质素促进了担子菌的相对丰度，降低了子囊菌的相对丰度；蚯蚓同样提高了担子菌的相对丰度，降低了子囊菌的相对丰度。但这一趋势在RLE处理中得到逆转，相比单一木质素RL处理，蚯蚓加木质素促进了子囊菌的相对丰度，降低了担子菌的相对丰度。
3 讨论木质素可以被用作土壤改良剂、肥料等，也是具有修复潜力的污染土壤生物刺激材料[13]。本研究中，木质素显著降低了黑麦草的生物量，这与Wu等[2]的研究结果一致。可能原因是，木质素结构复杂，在其降解过程中会产生酚酸类的小分子化合物[3]，而这些酚酸类物质与生物碱、萜类共同被称为自毒物质，对植物的生长有抑制作用。Blum[4]发现从植物组织或分泌物中分离出来的多种酚酸类物质会抑制植物生长，刘晓珍等[14]发现引起菊花连作障碍的主要原因包括酚酸类物质的积累和微生物区系的改变。酚酸类物质通过影响植物的膜系统、光合作用、土壤理化性质、酶活性和土壤微生物等，对植物生长产生抑制作用[15]。
在本研究中，木质素对细菌、真菌的数量具有明显的抑制作用，对细菌、真菌的群落结构也产生了很大的影响。这些变化可能与木质素的降解过程有关。木质素的分解释放出酚酸类结构单体和甲基，具有不同的降解途径。从细菌群落分析可以看出，在单一木质素RL处理中富集的Prolixibacteraceae、Bacteroidetes vadinHA17、Christensenellaceae、Sphingomonadaceae、Archangiaceae等门类，在植物生物质降解中常被刺激。例如，Ji等[16]研究发现，秸秆降解过程中后期土壤中Prolixibacteraceae的WCHB1-32和Bacteroidetes vadinHA17类群增加，表明它们可能参与秸秆难降解组分如木质素的分解；Christensenellaceae属于梭菌目，包括多种潜在的纤维素降解类群[16]；Sphingomonadaceae中的Sphingobium常用作木质素酚酸类单体的模式降解菌，Sphingobium SYK-6的降解途径已经得到深入研究[3]；Archangiaceae的Anaeromyxobacter主要是参与卤代芳香化合物的厌氧降解[17]。木质素代谢过程中释放出大量甲基，可以进入C1代谢，这解释了木质素对Methylophilaceae的促进作用，提示甲基营养代谢方式的存在[18]。另外，木质素明显地促进了真菌担子菌的相对丰度，主要是Tremellomycetes和Agaricomycetes，两者均具有降解木质素、纤维素和酚类物质的潜力[19]，Agaricomycetes中含有白腐真菌，而白腐真菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素[20]。总的来说，本研究中的木质素处理导致许多潜在降解菌属的富集，是木质素分解的有力证据，而分解中释放大量酚酸，可能是导致木质素胁迫黑麦草生长的主要原因。
蚯蚓是土壤生态系统的重要组分，蚯蚓的活动(取食、消化、排泄、分泌和掘穴)可以影响微生物的数量、活性和群落结构，从而影响植物生长[21]。本研究发现，蚯蚓能够显著促进黑麦草的生长，几乎达到未加蚯蚓处理的2倍。蚯蚓对细菌的数量和群落结构影响不大，显著富集Blastocatellaceae和Rhizobiaceae等。Blastocatellaceae与多聚物类碳源代谢显著正相关[22]；Rhizobiaceae的Rhizobium属于禾草内生固氮菌，具有固氮酶活性、溶磷、分泌植物生长激素等多种性能[23]。蚯蚓对真菌的数量有所提高，可能刺激根际土壤生物活性[24]，促进菌丝向植物传递养分作用，从而促进植物生长[25]。
蚯蚓能够缓解木质素对植物的抑制作用，显著促进植物的生物量。究其原因，一方面，可能是由于蚯蚓的作穴、搅动活动增加土壤的孔隙度[26]，加速包括木质素在内的土壤养分物质的循环[27]，促进植物吸收，并体现在土壤微生物数量方面；另一方面，蚯蚓可能影响木质素及其酚酸类产物的降解过程，缓解其对植物产生的化感作用，调节微生物群落，从而提高植物的生物量。毕艳孟和孙振钧[21]发现蚯蚓能够显著降低土壤中酚类化合物的残留，并且其降解过程主要是通过微生物作用。从本文结果可以看到，RLE处理中细菌和真菌rRNA基因拷贝数在4个处理中最高，是RL处理的2倍以上，表明在木质素和蚯蚓组合处理下，微生物活动也增强，这离不开木质素和蚯蚓的共同作用。添加了木质素的土壤经蚯蚓消化道后性质得到改善，有利于细菌对养分的利用，在这过程中蚯蚓分泌的代谢产物如黏液、尿素等，对土壤有机质产生刺激效应，从而刺激细菌的迅速生长[28]。郝月崎等[29]研究发现蚯蚓的加入对细菌和真菌数量的恢复都有一定的促进作用，添加了蚯蚓的处理组土壤pH更接近中性，可溶性有机碳含量更高，为土壤微生物提供了适宜的生长环境。对于木质素的潜在降解菌Prolixibacteraceae、Sphingomonadaceae、Methylophilaceae等，在木质素蚯蚓组合处理中，虽然其相对丰度比单一木质素处理略有降低，但鉴于微生物总体数量的增加，它们的绝对丰度或活性很可能得到提高。这些结果表明蚯蚓可能在培养过程中影响了木质素的降解过程，缓解了其分解过程中产生的酚酸类物质对植物的化感作用，从而促进了黑麦草的生长。张尊昊[30]在蚯蚓堆制处理花生壳的研究中发现，接种蚯蚓处理的羧甲基纤维素酶、微晶纤维素酶等酶活力高于未接种蚯蚓对照处理，纤维素、半纤维素、木质素的降解率也明显高于未接种蚯蚓对照处理。对于真菌而言，蚯蚓改善了木质素对真菌群落结构的影响，尽管RLE处理的担子菌相对丰度相对RL处理有所降低，但RLE处理的真菌数量几乎是RL处理的6倍以上，木质素降解菌的绝对丰度很可能得到提高，菌丝对养分的传递作用也可能得到增强。总体而言，蚯蚓可能在改善土壤微结构的同时，调节土壤微生物群落，影响了木质素及其酚酸类产物的降解，促进了养分供应，从而促进了黑麦草的生长。
4 结论木质素显著降低黑麦草的生物量，蚯蚓可以缓解木质素对黑麦草的胁迫作用。木质素影响土壤微生物群落，潜在木质素降解菌的富集表明木质素发生降解，而降解过程中释放出的酚酸类化感物质，可能是导致黑麦草生长受阻的主要原因。蚯蚓和木质素的联合作用，改善了土壤微生物群落结构，显著增加了细菌和真菌的数量，并改变了木质素降解菌的丰度，可见蚯蚓通过调节土壤中木质素及其酚酸类产物的转化，缓解其对植物的化感作用，从而改善植物的生长状况。本研究可为农业生产中木质素类物质的资源化利用提供科学依据。
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